线性聚乙烯亚胺的合成及转染实验

线性聚乙烯亚胺的合成及转染实验

材料

试剂

硫酸铜 (分析纯)

细胞培养基

HEPES缓冲葡萄糖溶液 (HBG; 5 % 葡萄糖 m /V ,20m m o l / L HEPES,pH 7.1)

0.2 um 滤膜过滤，4°C 保存

HEPES•缓冲生理盐水（H B S ; 150m m o l / L N a C l ，20m m o l / L H E P E S ,p. H 7. 1)

〇.2 um 滤膜过滤,4°C 保存

盐酸 ( 3 0 % ，分析纯）

小鼠, 体内试验用

五氧化二磷

质粒 D N A

聚合 (2-乙基-2-璁唑啉）（5 〇 kDa;Sigma-Aldrich 37，284-6)

乙酸钠 (分析纯）

氢氧化钠 (50% m /V ，分析纯）

硫酸 ( 3 0 % ，分析纯）

待转染细胞

仪器

烧杯

布氏漏斗

接点温度计

滤纸

0.2um 滤器

冰浴

多孔板

油浴

p H 试纸

分液漏斗

回流冷凝管

注射器 (I m l 胰岛素注射器， 33 号针头)

U V 分光光度计

37°C 水浴，用于体内实验

方法

L P E I 的合成与纯化

本合成需采取适当的安全保护措施！ L P E I 由酸催化水解聚 2-乙基-2-囉唑啉而成。

完全的脱丙酰作用对最终产物的转染性能非常关键 ( T h o m a s et al.2005)。

1•在 200 ml 30% 硫酸中溶解 45 g 聚 2-乙基-2-噁唑啉。

2.加热反应混合物并搅拌 6d , 通过共沸蒸馏除去生成的丙酸。

3•通过滴加蒸馏水使混合物的总体积保持不变。

4.106°C 处 理 5〜6d 后, 用 p H 试纸检测不到酸蒸气时，将溶液转移至烧杯中冰水浴冷却,

边搅拌边加人 N a O H 中止反应。注意: 反应放热！

5.冷却溶液直到沉淀出现。较慢的沉淀过程有利于增加收率。

6•在放置滤纸的布氏漏斗中过滤，用蒸锻水洗涤沉淀, 直到洗绦水变成中性。

7.用 P 2O 5 干燥 L P E I —周, 室温保存。

8.将 I O O m g L P E I 重 悬 于 I m l 蒸馏水 中 ，滴 加 H C l 调 节 p H 至 7.1，用蒸馏水定容至 2m l 。

9•用 0.2um 滤膜过滤 L P E I 溶液。过滤后用铜配合物法检测浓度。

10.直接储存 50m g /m l L P E I 储存液或稀释至 lm g /m l，4°C 保存 。 一 80°C 储存可延长使用期限。

L P E I 的定量

U n g a r o 等 (2003) 描述了用铜配合物法检测 L P E I 的方法。 L P E I 和加人的 C u II 离子形成深蓝色的铜氨复合物。

11.配 制 200m l 0. lm o l / L p H 5. 4 的乙酸钠缓冲液。

12•将 23m g C u S O 4 溶 解 在 I O O m l 上述乙酸钠缓冲液中，搅拌至澄清，标 计 为 C u (II)溶液。

13•在 100^1 蒸馏水中配制含 1〜I O m g L P E I 的标准溶液，5 个浓度梯度，平行两份，用蒸馏水作空白。

14•稀释不同量的待测 L P E I 溶液，总体积为 l 〇〇 ml。

15.在上述样品中加人 1(%1 C u (II) 溶液，混合后常温放置 5m i n 。

16•使用 U V 分光光度计测量溶液在 285n m 的吸光值，用标准曲线计算 L P E I 浓度。

制备 polyplex

1 7 . 制备 polyplex

计 算 N/P 比: 每个核苷酸平均分子质量为 330Da, 含 1 个 P ,L P E I 中平均 43D a 含 一 个 N 。例如 ，用 Iug 的 D N A 制备 N /P 比为 6 的 polyplex, 需要 LPEI 43X (6/330) =0. 78m g。 lm g/m l
的 L PE I 溶液相当于 N 的浓度为 23. 3 mmol/L 。

体外转染

a•用 H B S 分别稀释 DNAGO1UgAnl) 和 LPEI(31fxg/ml ), 等体积，N /P = 6 。

b. 转 移 L P E I 溶液至 D N A 溶液中，用移液器快速上下混合 5〜10 次。

c. 常温放置 20m i n 后用于转染实验。用含盐的缓冲溶液制备的 polyplex 随着放置时间的延长会出现团聚。

体内转染

a. 用 H B S 分别稀释 D N A (40(V g /m l ) 和 L P E I (3K V g /m l )，等体积，N /P = 6 。质粒和缓冲溶液均应不含内毒素。

b•转移 L P E I 溶液至 D N A 溶液中，用移液器快速上下混合 10 次。

c. 常温放置 20m i n 用于注射。

转染

18•转染操作

贴壁细胞的转染

a. 在转染前 1〜2d ,48 孔板中接种细胞。

细胞密度应为 5 0 % 〜70%

b•去除细胞培养基，代之以预热的新鲜培养基 (100〜200ul/cm2)。

c•加人 p 〇 lyple x (D N A 终 浓 度 0.5〜5ug/m l )。用手轻微的涡旋后在细胞培养箱培养。

d.4 h 后 ，用新鲜培养液替换转染液。

悬浮细胞的转染

a. 离心对数生长期的细胞，用新鲜细胞培养液重悬，细胞密度为 3X 10⁵ 个细胞/m l。

b. 48 孔板中每孔加 0• 5m l 细胞悬液。加 人 polyplex(含 DNAl〜 5ug ), 用手轻微的涡旋后在细胞培养箱培养。

c. 加含有 1〜5ug D N A 的 polyplex 溶液，轻轻的涡旋, 然后放在细胞培养箱里

d. 4 h 后 ，280 g 离心 5m i n ，小心地去除约 4 0 0 4 的上清, 补充 I m I 新鲜培养基。

在转染后 24〜48 h 观察到最佳转基因的表达, 但取决于细胞系和所转染的基因。

体内转染
a•固定小鼠，将尾巴浸在 37°C 水 浴 I m i n 扩张静脉。

b . I m l 的注射器 (33 号针头）吸 取 polyplex 溶液, 排出空气。在大概 5s 内静脉注射polyplex 溶液（200〜250m l )。

c. 注射 polyplex 到组织 (如肿瘤) 时，在注射的地方停留至少 I m i n 后拔出针头，防止液体漏出。