cDNA合成

一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术
　　Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：
　　20μg 特异性引物
　　200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris・Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 　　　　　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)
　　2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂
　　10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-
　　5μg 对照RNA
　　400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：
　　　　400mmol/L Tris・Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
　　　　30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
　　500μ RNase H
　　500μ DNA聚合酶Ⅰ
　　100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
　　2×1.25ml 不含核酸酶的水
　　以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

　　（一） 第一链合成
　　1. 试剂
　　[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。
　　2. 操作步骤
　　(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入
　　　5×第一链缓冲液 5μl
　　　rRNasin RNA酶抑制剂 25U
　　　M-MLV(H- )反转录酶 200U
　　　H2 O 调至总体积25μl
　　(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
　　(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时
　　(4) 取出置于冰上
　　(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。
　　(6) 第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成
　　注：以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。

　　（二） 第二链合成
　　1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入
　　　　10×第二链缓冲液 20μl
　　　　DNA聚合酶Ⅰ 23μ
　　　　RNase H 0.8μ
　　　　H2O 加至终体积为100μl
　　2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
　　3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。
　　4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。

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