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cDNA合成技术

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10184

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括:

20μg 特异性引物

200μl M-MLV第一链缓冲液(5×),配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;  15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂

10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-

5μg 对照RNA

400μl M-MLV第二链缓冲液(10×),配方如下:

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

(一) 第一链合成

1. 试剂

[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),EDTA (50mM和200mM),TE-饱和酚:氯仿(1:1),7.5M NH4Ac,乙醇(100%和70%),TE缓冲液。

2. 操作步骤

(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入。

5×第一链缓冲液 5μl

rRNasin RNA酶抑制剂 25U

M-MLV(H- )反转录酶 200U

H2O调至总体积25μl

(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

(4) 取出置于冰上

(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。

(6) 第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成

注:以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。


(二) 第二链合成

1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入

10×第二链缓冲液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至终体积为100μl

2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。

3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。

4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。

5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。

6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。

10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。

11、 小心移去上清液,干燥沉淀。

12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

(三)同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析

1. 试剂

1mg/ml鲑鱼精DNA, 三氯乙酸(TCA, 5%和7%),碱性琼脂糖胶,碱性胶电泳缓冲液,(30mM NaOH,1mM EDTA),2×样品缓冲液,(20mM NaOH,20% 甘油,0.025%溴酚蓝)。

2. 操作步骤

(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。

(2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。

(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。

(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。


3. 第一链产量测定

第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%

掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)

设330为每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%

例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:

掺入率=3040/254000×100%=1.2

掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。

4. 第二链产量计算

除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算

第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??

掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)-第一链掺入nmol]×第二链掺入率

第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol

双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng)

例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.

第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%

第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)-0.48nm]×1.18% =0.47nmol

合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng

双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98%

一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。

(四) 电泳分析

通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀,方法见本章(二)第二链合成中的9-12步,一般第一链和第二链上样量相同。

1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记

(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记

10×HindⅢ缓冲液 2.5μl

dATP 0.2mmol/L

dGTP 0.2mmol/L

[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi

λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg

Klenow DNA聚合酶 1μ

加H2O 到总体积25μl

(2) 室温放置10分钟, 加2.5μl 200mM EDTA终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。


2. 电泳分析

(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。

(2) 取样品液, 用TE调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油,0.025%溴粉兰)。

(3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。

(4) 将胶浸入7% TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。

(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。

 二、其它cDNA合成技术

除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外,Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒,不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同,有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等,其余试剂一样,这些系统包括:

20mg 引物

20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下:

250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L

MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;

20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。

50ml 40mM焦碳酸钠

625m rRNasin RNA酶抑制剂

600m AMV反转录酶

5mg 1.2kb对照RNA

200ml 10×第二链缓冲液,配方如下:

400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L

MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

2m E.Coli RNaseH

500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ

100m T4 DNA PolymeraseⅠ

1.5ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40mgmRNA。


(一)第一链合成

下面介绍的是25ml体积反应系统,该系统可合成多至2mgmRNA,每增加1mg mRNA,需增加反应体积10ml,如5mg mRNA需55ml反应体积。

引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为0.5mg/mg(对NotⅠ引物-延接头为0.3mg/mg)和15m/mg.

1、试剂:

[a-32P]dCTP(>400ci/mmol),EDTA(50mM和200mM),TE饱和酶/氯仿,7.5mM NH4Ac,100%和70%乙醇,TE缓冲液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。

2、操作步骤:

(1)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管加入的RNA样品,及引物或引物-延接头,用H2O调节0.5mg引物/mg mRNA(或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA)的体积至15ml,70℃加热5分钟,待冷至室温,离心数秒钟使溶液集中在管底,然后依次加入:

5×第一链缓冲液 5ml

rRNasinR RNA酶抑制剂 25ml

40mM焦碳酸钠2.5ml

AMV反转录酶 15m/mg RNA

加无水RNA酶水至总体积25ml

在加入焦碳酸钠和AMV反转录酶前,需将反应液42℃温浴5分钟,以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。

(2)轻弹eppendorf管,取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol)(其体积不能超过1ml),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

(3)42℃温浴1小时。

(4)取出置冰上。

(5)掺入测定的eppendorf管加入50mM EDTA,终止反应,并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析,另10ml进行同位素掺入测定。

(6)第一链合成离心管可直接用于第二链合成。

(二)第二链合成

第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。

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