cDNA合成技术

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成采用置换合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成，最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端，方法简便易行。该系统试剂包括：

20μg 特异性引物

200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP， dCTP， dGTP， dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂

10，000μ M-MLV反转录酶， RNase H-

5μg 对照RNA

400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ，pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40μg mRNA。

（一） 第一链合成

1. 试剂

[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。

2. 操作步骤

(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和适当引物，每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头，使用0.3μg)，用H2 O调整体积至15μl， 70℃处理5分钟，冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入。

5×第一链缓冲液 5μl

rRNasin RNA酶抑制剂 25U

M-MLV(H- )反转录酶 200U

H2O调至总体积25μl

(2) 用手指轻弹管壁，吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

(4) 取出置于冰上

(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应，并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提)，另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。

(6) 第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成

注：以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg，如合成5μg RNA，则可按比例扩大反应体积， 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。

（二） 第二链合成

1、 取第一链反应液 20μl， 再依次加入

10×第二链缓冲液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H₂O 加至终体积为100μl

2、轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定，可取出10μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。

3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA， 则需延长至3-4小时)。

4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA， 取10μl进行同位素掺入放射性测定，余下的可进行电泳分析。

5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟， 低速离心后置冰上。

6、 加入2μ T4 DNA聚合酶， 37℃温浴10分钟。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液，离心2分钟。

9、水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠，pH5.2)， 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃)， -20℃放置30分钟后离心5分钟。

10、 小心丢去上清液，加入0.5ml冰冷的70%乙醇，离心2分钟。

11、 小心移去上清液，干燥沉淀。

12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析

1. 试剂

1mg/ml鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA， 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。

2. 操作步骤

(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl，点于玻璃纤维滤纸，室温干燥， 这些样品代表总放射性活性。

(2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中，混匀，加入0.5ml 5% TCA， 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。

(3) 用玻璃纤维滤纸过滤，用冰冷的5% TCA洗三次，每次用5ml TCA，再用5ml丙酮或乙醇漂洗， 这些样品代表掺入放射性活性。

(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度，可用盖革计算器，也可用液闪计数。

3. 第一链产量测定

第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%

掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)

设330为每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%

例如总放射性活性强度为254，000cpm， 掺入放射性活性强度为3040cpm， 所用RNA摸板量为1μg，反应体积为25μl， 则:

掺入率＝3040/254000×100%=1.2

掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定，而反应体积占总体积80%，因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。

4. 第二链产量计算

除需去除第一链掺入dNTP外，方法同第一链产量计算

第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??

掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率

第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol

双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng)

例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp， 总放射性活性强度为235000cpm.

第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%

第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol

合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng

双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98%

一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。

（四） 电泳分析

通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基，需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提，乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12步，一般第一链和第二链上样量相同。

1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记

(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段，用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记

10×HindⅢ缓冲液 2.5μl

dATP 0.2mmol/L

dGTP 0.2mmol/L

[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi

λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg

Klenow DNA聚合酶 1μ

加H₂O 到总体积25μl

(2) 室温放置10分钟， 加2.5μl 200mM EDTA终止反应， 加入2×样品缓冲液，贮存于-20℃。

2. 电泳分析

(1) 用50mM NaCl， 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳， 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。

(2) 取样品液， 用TE调整体积， 使第一链和第二链产率测定液的体积相同，加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH， 20%甘油，0.025%溴粉兰）。

(3) 加样，电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH， 1mmol/L EDTA。

(4) 将胶浸入7% TCA中，室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色)，取出置滤纸上，干燥数小时。

(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶，室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。

 二、其它cDNA合成技术

除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外，Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括：

20mg 引物

20ml 5×第一链缓冲液， 配方如下：

250mmol/L Tris·Cl，pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L

MgCl₂; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;

20mmol/L dATP， dCTP，dGTP，dTTP(各5mmol/L)。

50ml 40mM焦碳酸钠

625m rRNasin RNA酶抑制剂

600m AMV反转录酶

5mg 1.2kb对照RNA

200ml 10×第二链缓冲液，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl，pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L

MgCl₂; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

2m E.Coli RNaseH

500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ

100m T4 DNA PolymeraseⅠ

1.5ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一链合成

下面介绍的是25ml体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA需55ml反应体积。

引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头为0.3mg/mg）和15m/mg.

1、试剂：

[a-32P]dCTP（>400ci/mmol），EDTA(50mM和200mM)，TE饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE缓冲液(10mM Tris·Cl，pH8.0，1mm EDTA)。

2、操作步骤：

（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管加入的RNA样品，及引物或引物-延接头，用H₂O调节0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：

5×第一链缓冲液 5ml

rRNasinR RNA酶抑制剂 25ml

40mM焦碳酸钠2.5ml

AMV反转录酶 15m/mg RNA

加无水RNA酶水至总体积25ml

在加入焦碳酸钠和AMV反转录酶前，需将反应液42℃温浴5分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。

（2）轻弹eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

（3）42℃温浴1小时。

（4）取出置冰上。

（5）掺入测定的eppendorf管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml进行同位素掺入测定。

（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成。

（二）第二链合成

第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。