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酸洗脱法获取抗原多肽(细胞毒性T细胞表位的鉴定)

相关实验:细胞毒性T细胞表位的鉴定

最新修订时间:

简介

酸洗脱法获取抗原多肽是指用一定强度的酸性缓冲液可将表位多肽和 β2M 从细胞表面洗脱下来,通过分离、纯化即可获得细胞天然表达的 CTL 表位多肽。

原理

酸洗脱法获取抗原多肽法的基本原理是:真核细胞能通过所表达的 MHC I 类分子将抗原的 CTL 表位以 MHC I 类分子、β2 微球蛋白(β2M)及 CTL 表位多肽所组成的复合物的形式递呈到细胞表面,用一定强度的酸性缓冲液可将表位多肽和 β2M 从细胞表面洗脱下来,通过分离、纯化即可获得细胞天然表达的 CTL 表位多肽。一般来讲,该方法所需的细胞数量要达到 1010 个才能收集到足够用于实验研究的多肽片段。

材料与仪器

器材:
离心机、HPLC、Sephadex G25 柱等。
试剂:
① 培养基和血清;
② IFN-γ;
③ PBS;
④ 枸橼酸-磷酸钠缓冲液或 0.1% 三氟乙酸(TFA);
⑤ 60% 乙腈;
⑥ 梯度洗脱液:10%-60% 的含 0.1% TFA 的乙腈溶液。

步骤

酸洗脱法获取抗原多肽法的基本过程可分为如下几步:

(1)培养 1010 个细胞。

(2)加入 50 IU/ml 的 IFN-γ 孵育一段时间。

(3)PBS 洗涤细胞 3 次。

(4)用 pH3.3 的枸橼酸-磷酸钠缓冲液室温处理细胞 1 分钟或用 0.1% 三氟乙酸(TFA)室温处理细胞 30 分钟。

(5)10000 g 离心,收集上清。

(6)上清用 Sephadex G25 柱吸附、浓缩分子量低于 5000 的多肽片段。

(7)60% 乙腈洗脱,收集洗脱液。

(8)洗脱液中的多肽片段采用 RP-HPLC 进行分离,10%~60% 的含 0.1% TFA 的乙腈溶液进行梯度洗脱,分步收集各多肽片段。

(9)冷冻干燥后 - 70 ℃ 保存、备用。

来源:丁香实验

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