简介
兔感染模型主要优点在于兔对 EHEC 感染和 Stx 毒素较为敏感，只需要较小剂量（每只 103CFU) 即可感染成功。此模型上观察到的临床症状与人类临床表现极为相似，如腹泻、出血性肠炎以及溶血尿毒综合征等。然而由于此模型涉及乳兔的养殖以及盲肠或小肠的接种，对实验人员的操作和实验条件要求较高。此外，在此模型中无法检测到细菌 LPS 相关的病理改变和 DIC 过程。
原理
兔感染模型是 EHEC 通过肠道（盲肠或小肠）直接接种感染乳兔（出生后 3 天），然后在定植部位引起兔肠道上皮细胞 AIE 损伤典型病例改变、上皮细胞凋亡、中性粒细胞浸润等病理改变，临床上表现为腹泻或者死亡，是典型的出血性肠炎或溶血尿毒综合征模型。此外，可以通过静脉直接注射志贺毒素攻击成年兔，除可引起类似的肠道病理改变外，还可以观察到毒素介导的血脑屏障破坏以及中枢神经系统病变。
用途
兔感染模型主要用于志贺毒素相关的致病机制、疫苗及治疗性抗体的研发方面，如 Stxl 与 Stx2 的毒力差异、沁关键毒力氨基酸的确定等，都是从此模型中得到的数据实验对应方法 4-实操信息。
材料与仪器
器材：新生新西兰大耳白兔，摇床
试剂：
① 链霉素溶液
② 无菌 PBS
③ LB 液体培养基
步骤
兔感染模型的基本过程可分为如下几步：
（一）流程一
A. 小兔预处理：新生新西兰大耳白兔在 SPF 条件下按常规方法饲养至 3-5 天，每 6-8 只子兔和母兔共同饲养于一个笼里。感染前注意观察兔粪便的黏稠度和形状，剔除排便异常子兔。
B. 细菌计数：将细菌接种到 LB 固体培养基上,37 ℃ 培养 18 小时。挑取单个菌落接种到 LB 液体培养基内， 37 ℃、150 r/min 摇床上培养过夜。取 100 μL 菌液接种千 10 ml LB 液体培养基内，37 ℃、150 r/min 摇床上培养，分别在 5 个不同的时间点取 1.5 ml 菌液，在入 = 600nm 处测定其吸光度值。取 100 μL 菌液加入到 900 μL 的无菌 PBS 中，充分混匀后，内取 100 μL 稀释后菌液加入到 900 μL 的无菌 PBS 中，混匀，如此反复、最后按照 10 倍梯度倍比稀释至 1:100。从每管中各取 100 μL 稀释后的菌液加入到 LB 平板上，用无菌 L 玻棒涂抹均匀，放入 37 ℃ 孵箱内培养 18 小时后进行平板计数。最后根据光密度值和细菌浓度对数值 ( Ig ) 之间的对应关系求得线性回归方程。
C. 盲肠接种：使用型号为 15 g 的尼龙管经门腔插入、导管末端经过胃、小肠后最后停留在盲肠部然后在盲肠处接种之前准备好的 EHEC 菌株 1X105 CFU。
D. 结果观察：可以直接观察兔的死亡及排便情况，此外可以根据需要，取肠道组织进行 HE 染色观察及电镜观察 A/E 损伤。
（二）流程二： 毒素静脉攻毒模型
A. 小兔预处理：新生新西兰大耳白兔在 SPF 条件下按常规方法饲养至 3-5 天，每 6-8 只子兔和母兔共同饲养于一个笼里。感染前注意观察兔粪便的黏稠度和形状，剔除排便异常子兔。
B. 毒素的纯化：
(1) 细菌上清液的准备：活化培养的 EHEC O157 EDL933 菌液，培养至 4 小时后加入终浓度为 0.4 mg/L 的丝裂霉素 C (mitomycin C), 然后继续培养 20 小时，250 r/min 离心收集上清液并用 0.45 μm 微孔滤膜过滤。
(2) 免疫亲和层析柱制备：将 lg 柱层析填料 CNB r-art ivaLPd Sppharosfe 4, 放入 1 mmol/L HCl 膨胀并充分洗涤. 把 Stx 特异性单克隆抗体与溶胀的柱埴料混合，用偶联缓冲液洗去多余的抗体分子，抗体－填料偶联物先后用两种缓冲液洗涤，分别为 0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl, pH4.0) 和 0.1 mol/L TrisHCI 缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl, pH 8.0)。将准备好的填料装柱，用 Binding Buffer 4 °C 平衡过夜。
(3) Stx 的纯化: ：免疫亲和层析柱用 Elulion Buffer(0.1 mol/L 甘氨酸－盐酸缓冲液 + 0.5 mol/L NaCl,pH 2.7) 洗 5 个柱体积，将备用的 Stx2 初提物上样，流速为 1 ml/min 用 Binding Buffer (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5) 重新平衡，洗至基线。用 5 个柱床体积 Elution Buffer 洗脱，收集洗脱峰。用中和液 (1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0) 调节 pH 至 7.0 。继续用 Elution Buffer 洗脱 5 个柱体积，用 Binding Buffer 平衡 5 个柱体积， 4 °C 保存免疫亲和层析柱。
(4) Lowry 法和 Western holtting 法测定 Stx 的浓度及免疫反应性。
C. 毒素攻毒：实验开始时小兔需禁食 24 小时，在次日恢复供水后肌内注射凯特明 [ (14 士 0.5) mg/kg]麻醉， 2.0 μg/kg( 高剂量）的纯化 Stx 毒素直接通过静脉注射。
来源：丁香实验
