丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

灵长类哺乳动物感染模型-肠出血性大肠埃希菌动物模型

相关实验:肠出血性大肠埃希菌动物模型

别名:Animal models of Infection disease,baboon,macaque

最新修订时间:

简介

灵长类哺乳动物感染模型,狒狒和恒河猴的遗传背景与人更相似,具体表现在志贺毒素受体 Gh3 在肾脏、小肠等脏器的分布与人的高度一致性,所以这两种动物特别是狒狒是较为理想的研究毒素以及溶血尿毒综合征的模型 C 研究发现引起拂拂肾衰竭及 HUS 典型症状的毒素用拭与人休用量一致,再次证实了二者的高度相似性, 除了毒素效应外,A/E 损伤及肠炎也能在恒河猴感染模型中稳定地观察到。该模型的最大不足就是实验动物购买、饲养及管理成本较高,几乎无法推广。

原理

灵长类哺乳动物感染模型的基本原理主要由 Stx 毒素介导。将纯化的毒素直接通过静脉或腹腔注射,毒素入血后与动物肾脏内皮细胞 Gh3 受体结合并导致细胞死亡,最终引起肾衰竭及溶血尿毒综合征。

用途

广泛应用于 EHEC 致病机制的研究,特别是 EHEC 介导的宿主上皮细胞 A/E 损伤的信号分子转导的研究。由其衍生的猪肠组织体外培养已经被公认为 A/E 损伤研究 ex vivo 模型的标准之一。此外,该模型还用于毒素的致病机制以及以毒素为靶点的治疗药物评价等方面。

材料与仪器

器材:柱层析填料 CNB r-art ivaLPd Sppharosfe 4, 电镜

试剂:

① 丝裂霉素 C

② 0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液

③ Elulion Buffer(0.1 mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液 + 0.5 mol/L NaCl,pH 2.7)


④ Binding Buffer (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)


⑤ 中和液 (1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0)


⑥ 凯特明 [ (14 士 0.5) mg/kg]

步骤

灵长类哺乳动物感染模型的基本过程可分为如下几步:

A. 毒素的纯化:


(1) 细菌上清液的准备:活化培养的 EHEC O157 EDL933 菌液,培养至 4 小时后加入终浓度为 0.4 mg/L 的丝裂霉素 C (mitomycin C), 然后继续培养 20 小时,250 r/min 离心收集上清液并用 0.45 μm 微孔滤膜过滤。

(2) 免疫亲和层析柱制备:将 lg 柱层析填料 CNB r-art ivaLPd Sppharosfe 4, 放入 1 mmol/L HCl 膨胀并充分洗涤. 把 Stx 特异性单克隆抗体与溶胀的柱埴料混合,用偶联缓冲液洗去多余的抗体分子,抗体-填料偶联物先后用两种缓冲液洗涤,分别为 0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液(含 0.5 mol/L NaCl, pH4.0) 和 0.1 mol/L TrisHCI 缓冲液(含 0.5 mol/L NaCl, pH 8.0)。将准备好的填料装柱,用 Binding Buffer 4°C 平衡过夜。

(3) Stx 的纯化: :免疫亲和层析柱用 Elulion Buffer(0.1 mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液 + 0.5 mol/L NaCl,pH 2.7) 洗 5 个柱体积,将备用的 Stx2 初提物上样,流速为 1 ml/min 用 Binding Buffer (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5) 重新平衡,洗至基线。用 5 个柱床体积 Elution Buffer 洗脱,收集洗脱峰。用中和液 (1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0) 调节 pH 至 7.0 。继续用 Elution Buffer 洗脱 5 个柱体积,用 Binding Buffer 平衡 5 个柱体积, 4 °C 保存免疫亲和层析柱。

(4) Lowry 法和 Western holtting 法测定 Stx 的浓度及免疫反应性。

B. 毒素攻毒:


实验开始时狒狒需禁食 24 小时,在次日恢复供水后肌内注射凯特明 [ (14 士 0.5) mg/kg]


麻醉, 2.0 μg/kg( 高剂量)的纯化 Stx 毒素直接通过静脉注射狒狒。

C. 模型观察:


攻毒 48 小时内观察狒狒死亡情况,可以处死动物,取肾脏、大肠、小肠、心脏、肺、脾、脑等组织切片进行 HE 染色或电镜观察 HUS 相关的脏器病例改变,如需测定血压、中心静脉压、心电图等指标,可以通过手术植入遥测芯片,动态实时监测毒素导致的病例改变。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序