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大鼠卵巢冻存保存方法

相关实验:大鼠胚胎、配子和卵巢冻存技术

最新修订时间:

简介

冻存(cryopreservation)是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于-196 ℃液氮中低温保存,可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来,这样在需要的时候再复苏用于实验。


适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢,可以防止因意外事件而造成丢种,起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。


除此之外,还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

材料与仪器

器材:


①冻存管
②无菌移液枪、枪头
③超低温冰箱
④程序冻存仪

⑤维纳斯剪刀


试剂:


①材料:大鼠
②DMSO
③10% 水合氯醛
④液氮
⑤含10% 胎牛血清的1640基础培养液
⑥红霉素软膏
⑦盐酸肾上腺素

步骤

大鼠卵巢冻存的基本过程可分为如下几步:


1.卵巢采集 选择需要冻存保存的大鼠,颈椎处死;打开腹腔,分离生殖系统,小心暴露卵巢,撕开卵巢胞膜露出整个卵巢;用弯头的维纳斯剪刀贴着卵巢门动静脉处整个剪下卵巢;在另一侧重复同样的操作。


2.摘除卵巢去势 以体积分数10% 水合氯醛进行腹腔注射麻醉;下腹部消毒,正中线最下胸骨与脊椎处开口,暴露卵巢与输卵管及周围的脂肪等;小心在卵巢胞膜上开一个小口,露出整个卵巢。


用弯头的维纳斯剪刀贴着卵巢门动静脉处整个剪下卵巢;滴加盐酸肾上腺素控制出血;另一侧重复同样的操作;缝合肌肉和皮肤;将大鼠放在保温台上保温,等待苏醒;伤口涂红霉素软膏抗感染。


3.冻存前处理 取出大鼠卵巢后,立即置于4℃ 含10% 胎牛血清的1640基础培养液中;轻轻洗去血迹,用手术刀片将系膜去掉。


4.卵巢冻存 配制卵巢冻存缓冲液(如表),放入冻存管中,冰浴。将卵巢移入装有冰浴的冻存缓冲液的冻存管中,平衡30分钟;将冻存管放入程序冻存仪,从4 ℃开始,以2 ℃/min的速度降至-7 ℃。


-7 ℃渗透10分钟然后植冰;以0.3 ℃/min的速率降至-40 ℃;以10 ℃/min的速率降至-140 ℃;投入液氯中保存。


卵巢冻存缓冲液
成分 浓度 成分 浓度 成分 浓度
DMSO 1.5mol/L 胎牛血清 10% 蔗糖 0.1mol/L

来源:丁香实验

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