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巨噬细胞趋化功能测定

相关实验:巨噬细胞趋化功能测定

最新修订时间:

简介

巨噬细胞迁移是其在感染及损伤部位发挥免疫活性的首要条件,巨噬细胞趋化功能反映其迁移能力,是评价巨噬细胞免疫功能的主要指标之一。


因此,对于巨噬细胞免疫功能研究有必要建立有效的体外趋化功能检测方法,用于观察不同应激状态下的巨噬细胞趋化功能。

原理

巨噬细胞趋化功能测定的基本原理是Transwell小室根据靶细胞能够趋化性主动迁移,穿过一定孔径的滤膜而设计。


滤膜将小室分隔成上下两部分:靶细胞在上面,趋化因子在下面,趋化因子通过滤膜形成梯度,细胞则沿着梯度穿过膜孔,黏附在膜的下面,染色并计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化子的趋化能力。

材料与仪器

试剂:


趋化因子(酵母多糖活化的血清)


Giemsa染液,PBS,甲醇


仪器:


Transwell趋化小室

步骤

巨噬细胞趋化功能测定的基本过程可分为以下几步:


(1)分离小鼠腹腔巨噬细胞,用PBS(pH7.2)将其调整为2x108/L~3x108/L。


(2)将趋化因子溶液25 μl加入趋化小室的下室。将左上方剪去一小角的滤膜光滑面朝向趋化因子盖于孔上。


(3)盖上趋化小室的上室部分,用固定器夹紧。


(4)将50 μl细胞悬液加入上室。注意操作时不能产生气泡,以免气泡妨碍细胞移动。


(5)各孔注入单核细胞悬液后,盖以25 mmx80 mm的载玻片,覆盖全部孔。在37 ℃、5% CO2温箱中静置90分钟诱导细胞趋化移动。


(6)从温箱中取出多孔趋化小室;松开固定器,将小室上、下倒置放在预先准备好的纸垫上,取下滤膜。


(7)将事先切下一角的滤膜一边用大铗子固定,另一侧用小铗子夹好。


(8)将朝向单核细胞的滤膜面(即无光泽面朝下)浸入生理盐水内,将大夹子一边的滤膜从液体中轻轻拉起(与容器呈30°角),即可将未移动的细胞从滤膜上洗脱下来。


(9)将滤膜光泽面朝上,贴在事先涂有蛋清甘油(甘油与蛋清等量混合而成)的载玻片(40 mmx80 mm)上,冷风吹干滤膜后,用甲醇固定,进行Giemsa或瑞氏染色。

注意事项

(1)需在缓冲液中加入牛血清白蛋白或小牛血清,否则效果不佳。


(2)如用聚碳酸酯(polycarbonate)滤膜时,应注意其正反面,必须将有光泽的一面作为吸引物面。


(3)多孔趋化小室装置不能浸入有机溶剂或洗涤剂中,否则会造成丙烯树脂溶解或洗涤剂在孔内的沉着。


也不能放入烘箱烤干,只能用大量流水冲洗干净,再用双蒸水冲洗后自然干燥。


(4)巨噬细胞数和培养时间随滤膜孔径而改变,应预先选择最适条件。

来源:丁香实验

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