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单核-巨噬细胞趋化功能的检测

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单核-巨噬细胞趋化功能的检测
 
【试剂及材料】
(1)         趋化因子(见附注)
(2)         Hanks液(pH7.2)
(3)         特制的上、下两层多孔趋化小室
(4)         Giemsa或瑞氏染液
【操作方法
(1)         分离单核细胞,用Hanks液(pH7.2)调整为2~3×105 细胞/ml;
(2)         将趋化因子液25μl加入趋化小室的下室。将滤膜光泽的一面朝向趋化因子盖在孔上,并将滤膜左上方剪去一小角;
(3)         盖上趋化小室的上室部分,用固定器夹紧;
(4)         将单核细胞悬液50μl注入上室。操作时不能产生气泡,因气泡妨碍细胞的移动;
(5)         各孔注入单核细胞悬液后,盖以25mm×80mm的载玻片,覆盖全部孔。在37℃,5%CO2 温箱中静置90min诱导细胞趋化移动;
(6)         从温箱中取出多孔趋化小室;松开固定器,将小室上、下倒置放在预先准备好的纸垫上,取下滤膜;
(7)         将事先切下一角的滤膜一边用大铗子固定,另一侧用小铗子夹好;
(8)         将朝向单核细胞的滤膜面(即无光泽面朝下)浸入生理盐水盘内,将大铗子一边的滤膜从液体中轻轻拉起(与容器呈30o 角),即可将未移动的细胞从滤膜上洗脱下来;
(9)         将滤膜光泽面朝上,贴在事先涂有蛋清甘油(甘油与蛋清等量混合而成)的载玻片(40mm×80mm)上,冷风吹干滤膜后,用甲醇固定,进行Giemsa或瑞氏染色;
【结果分析】
    用低倍镜确认移动细胞后,换用400倍高倍镜任意计数10个视野内的移动细胞的总数,其结果为××个细胞/10 HPF(高倍视野),每个样品至少重复计数3次。如用缓冲液代替趋化因子,细胞数超过100/10 HPF时,应重新调整单核细胞数再检测。
【注意事项】
(1)         试验中一般用人或动物外周血分离的单核细胞,如以动物腹腔中MΦ作为指示细胞时,需在缓冲液中加入牛血清白蛋白或小牛血清,否则效果不佳。
(2)         如用聚碳酸酯(polycarbonate)滤膜时,应注意其正反面,必须将有光泽的一面作为吸引物面。Nucepore公司出品的趋化试验用滤膜分为PVP处理和未经过处理的两种。前者适用于单核-巨噬细胞,后者适用于中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。也有人将未经PVP处理的滤膜用明胶或L-赖氨酸覆盖后,用于纤维母细胞或内皮细胞移动功能的检测。
(3)         多孔趋化小室装置不能浸入有机溶剂或洗涤剂中,否则会造成丙烯树脂溶解或洗涤剂在孔内的沉着;也不能放入烘箱烤干,只能用大量流水冲洗干净,再用双蒸水冲洗后自然干燥。
(4)         单核细胞数和培养时间随滤膜孔径而改变,应事先选择最适条件。
【附注】趋化因子的制备
(1)常用酵母多糖活化的血清作为趋化因子。取酵母多糖加到新鲜血清中,浓度为 2mg/ml,37℃水浴保温30min后,3000r/min离心30min。
(2)上清液再经56℃30min加热处理,即为趋化因子,-30℃保存。加样前在37℃预温10~20min。
   
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