简介
除了 ELISA 以外，还可以通过分离肠上皮内淋巴细胞及黏膜内淋巴细胞分析肠道免疫功能，分离得到的细胞可进行原代培养用于各种药物刺激及免疫相关的实验，及流式细胞组分分析，如细胞活力、凋亡、亚群分类等。
原理
流式细胞分析法评价肠道免疫基本原理是通过检测肠道内不同性质淋巴细胞的相对数量。
材料与仪器
器材：
① 手术器械
② 20 ml 注射器
③ 尼龙纤维
④ 洁净的 80 目和 400 目过滤尼龙布
⑤ 15 ml 和 50 ml 离心管
⑥ 小鼠
试剂：
① CMF 溶液（100 ml 10 x 无钙镁离子的 HBSS；100 ml 10 x HEPES 缓冲液；20 ml FBS；加入去离子水至 1 L，无菌过滤后 4 ℃ 保存）
② RPMI1640
③ 胎牛血清
④ Percoll 溶液
⑤ CMF/FBS/DTE 溶液（在 92 ml CMF 中加入 8 ml FBS 得到含 10% FBS 的 CMF，再加入 15.4 mg 二硫赤藓糖醇（DTE），现用现配）
步骤
流式细胞分析法评价肠道免疫的基本过程可分为如下几步：
A、脱颈处死小鼠，打开腹腔，小心地分离需要的小肠部分，或从胃下 0.5 cm 到盲肠上 1 cm 的全部小肠。
B、使用充满冰冷 CMF 溶液的 20 ml 注射器，用镊子使插入肠腔的针头与入口位置相对固定，用稳定的速度（如 5 ml/min）缓慢地将 CMF 溶液注入肠腔内，使流出液汇集在洁净的平皿中。最终用 40 ml CMF 溶液冲洗完整个肠腔。
C、在 CMF 浸润的平板纸上小心地用镊子和眼科剪剪去肠外壁的结缔组织，及肉眼可见的所有派伊尔结。将整个小肠纵向剪开，并剪断成约 0.5 cm 长的小段。
D、将剪下的小段肠壁放入含有 40 ml CMF 溶液的 50 ml 离心管中，上下颠倒数次，静置使组织下沉，倾去上层液体，重复 3 次以上直到液体澄清。
E、将小肠组织转移到含有 20 ml CMF/FBS/DTE 溶液的 50 ml 锥形瓶中，加入搅拌子，用封口膜密封口部，37 ℃ 加热搅拌 20 分钟。
F、将所有液体和组织转移到 50 ml 管中，盖严，高速涡旋 15 秒，待组织下沉后将含有细胞的液体部分转移到另一个洁净的 50 ml 管内。
G、再向组织中加入 20 ml CMF/FBS/DTE 溶液，重复第 6 步，将两次得到的液体合并，在冰上孵育 5 分钟。转移含有细胞的上清至新的 50 ml 管，弃去沉淀的组织碎片。
H、再将肠组织放入锥形瓶中，重复步骤 5-7，合并两次得到的上清，400 g，4 ℃ 离心 5 分钟，用 5 ml RPMI1640（4 ℃）重悬离心得到的细胞，上述步骤始终在冰上或低温操作。
I、称取约 0.3 g 尼龙纤维，仔细撕成细条，塞入 10 ml 注射器并用注射器的活塞压紧。在 4 ℃ 下用 20 ml 的 RPMI1640 洗涤尼龙纤维。将上一步中得到的细胞悬液加入尼龙纤维管中过滤，立刻再用另外的 10 ml RPMI1640 洗涤纤维，在 50 ml 管中收集过滤得到的液体，此步用于吸附去除多余的上皮细胞。对于肠组织较少的实验，为了提高细胞产率，此步可选做，上皮细胞在后续的梯度离心分层过程中也可以基本去除。
J、将细胞分别通过 80 目和 400 目的洁净的过滤尼龙布，并分别用 5 ml RPMI1640 洗涤一次过滤后的网布。将过滤后的细胞悬液收集在 50 ml 离心管内。
K、重复一次低温 400 g 离心步骤，用 24 ml 的 44% Percoll 溶液重悬细胞。
L、准备 3 个 15 ml 离心管，用 FBS 润洗小管内壁。吸去多余 FBS 液体。在每个小管中加入 5 ml 的 67% Percoll 溶液，再小心在上面加入 8 ml 之前得到的含有细胞的 44% Percoll 溶液。
M、将离心机升降速刹车调到最低，600 g 室温离心 20 分钟。
N、不同浓度的 Percoll 溶液分界位置出现明显的细胞层，小心地用吸管吸取尽量多的细胞，以 1:3 的体积比加入 4 ℃ 的 RPMI1640 重悬细胞，4 ℃ 400 g 离心 5 分钟，得到的细胞即为肠上皮内淋巴细胞。
O、将剩余的肠组织重新放入洁净的锥形瓶，加入 20 ml 37 ℃ 预热的 RPMI-10/胶原酶，100～300 r/min 的转速下 37 ℃ 搅拌 1 小时。
P、按照之前描述，将得到的液体重新用尼龙纤维进行过滤，冰上等待，组织再重复 1～2 次步骤 15，直至没有肉眼可见的组织块，结束后用 1 ml 枪头吹打混悬液，使组织充分消化后全部过滤。
Q、将得到的含有细胞的液体 850 g 离心 10 分钟，弃上清。细胞用 CMF/HEPES 洗两次，用 2～3 ml CMF/HEPES 重悬细胞。R 按步骤 11-14 分离本次消化得到的细胞内的淋巴细胞部分，即为黏膜内淋巴。
细胞结果示例如图 8-3-7 所示：
来源：丁香实验
