小鼠脾脏树突状细胞磁珠分选法分离纯化

小鼠的脾脏 DC 是研究最多的淋巴组织 DC。脾脏 DC 的特征为组成性表达 MHC II 类分子和 CD11c。该群细胞可进一步分为三群：主要分布于边缘区的 CD4＊CD8-CD11b＋DC，主要分布于 T 细胞区的 CD4-CD8＊CD11bDC 和双阴性的 CD4-CD8CD11b＋DC，其中，CD8＋DC 表达 CD1d 和 DEC-205，根据需要可选择不同的方法将脾脏 DC 分选出来。

磁珠分选法小鼠脾脏树突状细胞分离纯化的基本原理是小鼠 DC 表面均表达 CD11c，因此，将包被了磁珠的 CD11c 抗体与小鼠淋巴组织或非淋巴组织细胞悬液共孵育并置于磁场后，结合了 CD11c 抗体的细胞将留在分选柱中，脱离磁场后可分离得到 CD11c 阳性的 DC。该方简单易行，若操作得当，细胞纯度可以达 95％ 以上。

试剂：

小鼠、RPMI 1640 培养液、胎牛血清、含 2 mmol／L EDTA、1％ 胎牛血清的预冷的 PBS

仪器：

小鼠脾脏树突状细胞磁珠分选法分离纯化的基本过程可分为以下几步：

（1）将小鼠脾脏通过胶原酶 D 消化或钢网研磨制备脾细胞悬液，将其通过 30 μm 的尼龙网过滤后去除细胞团块后，得到单细胞悬液。

（2）计数细胞，离心，弃尽上清后，每 108 个细胞加 400 μl PBS 重悬细胞。

（3）将重悬好的 400 μl 细胞悬液中加入 100 μl CD11c 磁珠。混匀后于 4 ℃ 孵育 15～20 分钟。

（4）用预冷的 PBS 离心洗涤 1 次，弃尽上清后，用 500 μl PBS 重悬细胞。

（5）离心期间，将 MACS 分离磁铁安装到 MACS 支架上，并将 MS 分选柱放到磁体中，在分选柱下置一支离心管。用预冷的 MACS 缓冲液冲洗分选柱 3 次，每次 0.5 mL，弃洗脱液。

（6）将细胞悬液上样到分选柱上。

（7）用 MACS 缓冲液冲洗分离柱，每次 0.5 mL，洗 3 次。第一个 0.5 mL 应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。

（1）死细胞会非特异地结合磁珠，因此操作中要注意减少死细胞的生。若死细胞过多，可以通过密度梯度离心或死细胞清除试剂盒来去除。

（2）缓冲液中务必加入 EDTA 或类似物，维持细胞呈单细胞悬液状态，减少由于多个细胞粘连在一起而造成的非特异标记。

（3）为获得高纯度的 DC，可以通过利用 Fc 受体阻断试剂（即 CD16／32 抗体）或小鼠免疫球蛋白来阻断 DC 表面的 Fc 受体，从而避免 Fc 受体介导的磁珠结合，提高 DC 的纯度。

（4）与磁珠孵育最好在 4 ℃ 进行，温度过高或孵育时间过长会导致磁珠非特异黏附。