小鼠脾脏树突状细胞贴壁法分离纯化

小鼠的脾脏 DC 是研究最多的淋巴组织 DC。脾脏 DC 的特征为组成性表达 MHC II 类分子和 CD11c。该群细胞可进一步分为三群：主要分布于边缘区的 CD4＊CD8-CD11b＋DC，主要分布于 T 细胞区的 CD4-CD8＊CD11bDC 和双阴性的 CD4-CD8CD11b＋DC，其中，CD8＋DC 表达 CD1d 和 DEC-205，根据需要可选择不同的方法将脾脏 DC 分选出来。

贴壁法小鼠脾脏树突状细胞分离纯化的基本原理是小鼠脾脏 DC 在体外可黏附于玻璃或塑料表面，但培养 18～24 小时后，其黏附能力逐渐丧失，借此可与巨噬细胞分离。该方法无需特殊试剂，不需要进行密度梯度离心，操作简便、省时。但用此种方法获取的 DC 数量少、纯度低，而且分离所得的 DC 处于不同的分化阶段，无法满足精细实验的需要。

试剂：

小鼠脾脏细胞悬液、红细胞裂解液 0.02mol／L Tris-HCl（pH7.2），0.14mol/L NH4Cl、RPMI 1640 培养液、胎牛血清

仪器：

小鼠脾脏树突状细胞贴壁法分离纯化的基本过程可分为以下几步：

（1）将小鼠脾脏通过胶原酶 D 消化或钢网研磨制备脾细胞悬液，将其通过 30 μm 的尼龙网过滤后去除细胞团块后，得到单细胞悬液。Tris-NH，Cl 裂解红细胞后，用含有 5％ 热灭活胎牛血清的 RPMI 1640 将脾脏细胞悬液调节细胞浓度至 1x107 个／mL。

（2）将脾脏细胞悬液分装于 100 mm 平皿内，每板 10 mL，于培养箱内培养，使树突状细胞和巨噬细胞黏附于培皿表面。

（3）1～3 小时后弃去无黏附作用的淋巴细胞（主要是 T 细胞和 B 细胞），用 RPMI 1640 培养基清洗 2 次，弃尽液体，补充含有 10％ 热灭活胎牛血清的 RPMI 1640。