贴壁法分离基质干细胞

干细胞（stem cells，SC）是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。骨髓中含有造血干细胞（hematopoieticstem cells，HSC）和基质干细胞（stromal stem cells，SSC）。造血干细胞是指具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板的一类干细胞，它们在适当条件下也可以分化成其他细胞。骨髓基质干细胞具有成纤维样细胞外观、贴壁生长的培养特点，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种间充质细胞，所以又称其为骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）。小鼠骨髓造血干细胞及基质干细胞常常应用于干细胞的各个方面的研究，分离和培养小鼠骨髓造血干细胞及基质干细胞是开展相关研究的基础。

贴壁法分离基质干细胞的基本原理是利用其贴壁的特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化的目的。

试剂：

1．淋巴细胞分层液（密度为 1.082 的 percoll 液）。

2．PBS，pH7.2～7.4,4 ℃ 避光保存备用。

3．胰蛋白酶，2.5 g／L，4 ℃ 保存备用。

4．完全 LDMEM（2 mmol／LL 谷氨酰胺，10x104 IU／L 个青霉素和 25 μg／L 两性霉素）。

5．锥虫蓝染液。

仪器：

1．15 mL 或 50 mL 聚丙烯锥形离心管。

贴壁法分离基质干细胞的基本过程可分为以下几步：

1．用 21 号针头注射器插入 3～4 周龄小鼠的股骨干，10 mL 含 200 mL／L 胎牛血清的完全 LDMEM（2 mmol／LL-谷氨酰胺，10x104 IU／L 个青霉素和 25 μg／L 两性霉素）冲洗骨髓腔。

2．用密度为 1.082 的 rcrcoll 液分离，500 gx30 分钟离心后，取中间的单个核细胞层，PBS 洗 2 次，接种于 LDMEM 培养基。

3．接种于 25 c㎡ 的培养瓶中，37℃，50 mL／LCO2 浮箱静置培养。

4．于接种 2 天后进行第 1 次换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后 3～4 天更换培养液 1 次。

5．原代培养的细胞达 80％ 融合时，即可用 2.5 g／L 胰酶将贴壁细胞消化分离（37 ℃，3～5 分钟），然后按 1：2 传代，并为 P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，再重复以上操作，传代培养记为 P2，余类推。

1．除了用密度梯度离心法分离单个核细胞外，还可以使用全骨髓培养法，即取小鼠的股骨和胫骨，直接用培养基冲出骨髓，一定要尽量把干骺端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24～48 小时后去悬浮细胞，再接下来的每 3～4 天换液一次，直到需要传代。

2．随着对 MSC 表面抗原认识的深入，有学者利用免疫方法如流式细胞术、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，且此法耗费较大。

3．MSC 贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll 分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养，可添加 bFGF 和（或）表皮生长因子增强其增殖能力。

4．骨髓基质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为基质细胞不易贴玻璃，而且质量好的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质。