免疫磁珠分选分离小鼠骨髓造血干细胞

干细胞（stem cells，SC）是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。骨髓中含有造血干细胞（hematopoieticstem cells，HSC）和基质干细胞（stromal stem cells，SSC）。造血干细胞是指具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板的一类干细胞，它们在适当条件下也可以分化成其他细胞。骨髓基质干细胞具有成纤维样细胞外观、贴壁生长的培养特点，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种间充质细胞，所以又称其为骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）。小鼠骨髓造血干细胞及基质干细胞常常应用于干细胞的各个方面的研究，分离和培养小鼠骨髓造血干细胞及基质干细胞是开展相关研究的基础。

免疫磁珠分选分离小鼠骨髓造血干细胞的基本原理是通过免疫细胞表面的抗原与连接着磁珠的特异性抗体相结合，在外加磁场中，与免疫磁珠相结合的免疫细胞被吸附于磁场中，使这些细胞与其他不能结合磁珠的细胞分离。免疫磁珠法分为正选法和负选法：如果磁珠结合的细胞是所要分离获得的细胞，即为正选法；如果磁珠结合的是不需要的细胞，即为负选法。这需要根据具体实验的需要进行选择。免疫磁珠分选免疫细胞的纯度和获得率与磁珠所连接单抗的特异性和磁珠的特性有密切关系，体积小的磁珠一般来说对分离细胞的后续培养影响小，如磁珠直径为 50 nm 左右；大磁珠的缺点可能会影响分选细胞的生物学活性，不利于分离后的细胞培养。随着相关技术以及仪器设备的发展，通过磁珠分选细胞越来越简便，且纯度和获得率越来越高，而对细胞的影响也越来越小。

目前市场上可购买到不同厂家生产的分选各种细胞的磁珠，每种产品均能提供详细的分选规程，因此，通过磁珠分选细胞越来越方便。

试剂：

1．前法制备的人外周血单个核细胞。

2.1xPBS，含 0.5％BSA 和 0.5 mmol／L EDTA。

3．FITC 标记的 CD14 抗体（CD14-FITC）。

4．商品化鼠抗人 CD14 免疫磁珠（IgG2a），用 0.1 BSA 和 0.05％ 叠氮钠（sodium azide）稀释。

仪器：

1．磁性细胞分选器（提供高能磁场）。

免疫磁珠分选分离小鼠骨髓造血干细胞的基本过程可分为以下几步：

1．离心收集待分离细胞，将细胞悬浮于 PBS（10＇细胞悬浮于 80 μlPBS ）。

2．加入免疫磁珠（每 10＇细胞加入 20 μl），充分混悬细胞后，置 6～12 ℃ 孵育 15 分钟。

3．加入原体积 10～20 倍的 PBS，混悬细胞后，1700 r／min 或 300 g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞并将细胞悬浮于 PBS（10 细胞悬浮于 500 μlPBS）。

4．根据所分选的总细胞量选择不同规格的阳性分离柱（如有些磁珠可分离的最大阳性率为 10％，因此如果目的细胞亚群的阳性率大于 10％，建议采用更大的分选柱或者将总细胞量减低，使得停留在柱中的阳性细胞不大于所选用的分离柱最大总细胞量的 10％），将分离柱安装入磁场中。

5．用 1xPBS 洗分离柱中，每次自然流尽，共洗柱 3 次（所用 PBS 的量也需根据所选择分离柱的规格确定）。

1．若分离细胞用作培养，需在超净台中完成所有操作过程。

2．此法分离的细胞纯度一般可以达到 80％～99％，获得率在 60％～90％ 左右，取决于目的亚群在总细胞中的百分比，一般说来，5％ 的亚群分选纯度可达到 95％ 以上，稀少亚群一次分选的纯度达不到 90％，需要进行 2 次分选才会达到。尽管低于流式细胞仪（FACS）的分选效率，但此法设备简单，且所用时间较短，分离效率高，因而目前已经得到推广。

3．阳性选择后，如需用第二种表面标志继续分离，可用剪切酶剪切与细胞结合的磁珠，再次进行下一轮分选。如需进行细胞功能分析，也可经培养 12～24 小时，使结合的磁珠生物降解后进一步使用阳性选择的细胞做研究。

4．分离柱一般只能一次应用，再用时降低分离效率。

5．分选下的阳性细胞可用荧光标记的抗体通过 FACS 鉴定纯度；注意荧光抗体针对的抗原表位要选择与分选时所用的磁珠包被抗体不同的表位。

6．待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高 EDTA 浓度。

7．抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合，因而分选前去除死细胞。

8．新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA 酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。

9．上分离柱前，需充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块，或者采用厂家提供的筛网过滤团块，否则会发生堵塞。