小鼠骨髓前体细胞培养树突状细胞

树突状细胞（dendritic cell，DC）在体内数量极少（它在脾脏贴壁细胞中所占的比例小于 1％），从体内分离 DC 耗时而且细胞产量很低，大大延缓了对 DC 的研究。因此，从前体细胞诱导培养大量的 DC 方法的建立，对于研究 DC 的生物学功能具有重要的意义。

小鼠骨髓前体细胞培养树突状细胞的基本原理是小鼠骨髓中含有大量的造血干细胞，可通过 GM-CSF 和 IL-4 定向诱导 DC 的前体细胞向 DC 分化发育。由该方法可获得用于研究的足量的、分化发育状态基本一致的树突状细胞，这是目前最常用的小鼠树突状细胞的获得方法。需要注意的是，尽管天然存在的小鼠 DC 包括 CD4＋CD8、CD4CD8＋和 CD4-CD8- 3 个亚群，但目前通过体外培养只能产生 CD4-CD8 这一亚群；此外，不同实验室依据自己的经验在应用该方法的过程中也有不同程度的改进。

试剂：

5～6 周龄小鼠、室温以及 4℃ 的 RPMI 1640 培养基、红细胞裂解液 0.02mol／L Tris-HCl（pH7.2）；0.14mol/L NH4Cl、小鼠 GM-CSF 和 IL-4、用于流式细胞仪检测 DC 的抗体

仪器：

小鼠骨髓前体细胞培养树突状细胞的基本过程可分为以下几步：

（1）无菌取小鼠股骨和胫骨，置于 4 ℃ 的 RPMI1640 培养基中，用 1 mL 注射器将骨骺端戳穿后，多次吸取 RPMI 1640 培养基，反复冲洗骨髓腔，直至骨头变白，以获得足够的骨髓细胞。

（2）将获得的骨髓细胞通过筛网（去除颗粒）过滤后收于离心管内，室温 280 g 离心 5 分钟，弃上清。

（3）加入 3～10 mL 的红细胞裂解液裂解红细胞。室温静置 3 分钟后，室温 280 g 离心 5 分钟，弃上清。

（4）用 RPMI 1640 洗涤骨髓细胞 2 次，室温 280 g 离心 10 分钟。计数活细胞，用完全 RPMI 1640 培养基调整细胞浓度至 1x106 个／mL～2x106 个／mL。

（5）加入小鼠重组 GM-CSF 至终浓度为 10～20 ng／mL，小鼠重组 IL-4 至终浓度 1 ng／mL 将细胞悬液 4 mL／孔接种于 6 孔板。

（6）3 天后，可见板底长出集落。轻轻地摇动培养板，使未贴壁的细胞悬浮于液体中，倾斜培养板，移出培养基后，将 RPMI 1640 轻轻地沿孔壁加入孔中，轻轻摇动培养板后吸出洗涤液，最后每孔加入 4 mL 含 10～20 ng／mL rmGM-CSF 和 1 ng／mL rmIL-4 的完全 RPMI 1640 培养基。

（7）在第 5 天到第 8 天期间（此时已产生足够的聚集体），每 1～2 天半量换液一次（倾斜培养板，移出 2 mL 培养基后，每孔沿孔壁加入 2 mL 含 10～20 ng／mL rmGM-CSF 和 1 ng／mL rmlL-4 的完全 RPMI 1640 培 养基。

（8）第 8 天后，收集脱离的细胞，于室温 280 g 离心 10 分钟，弃上清。用含 10～20 ng／mL rmGM-CSF 和 1 ng／mL rmIL-4 的完全 RPMI 1640 培养基重悬，最高浓度为 1x106 个／mL。然后铺 100 mm 培养皿，每个培养皿 10 mL。

（9）在细胞转移后 24～48 小时内，每 24 小时轻轻摇晃培养皿，收集非贴壁、非增殖、成熟的 DC，转移至另外的收集管中用于后期的研究。

（1）选用的小鼠最好为 5～6 周的雄性鼠，骨头比较粗大，诱导的 DC 量多；运输后需要休息至少 5 天；不要使用应激或脱水的小鼠。

（2）用于裂解红细胞的氯化铵的用量和作用时间根据经验决定。