生物素化膜蛋白提取法结合免疫沉淀法测定细胞膜蛋白质含量

生物素化膜蛋白提取法能够获得高纯度的膜蛋白，缺点是在使用抗生物素蛋白作为生物素化蛋白的纯化结合分子时，常需要用蛋白变性的方法分离结合的蛋白，影响后续研究。

原理

生物素化膜蛋白提取法（biotin-label membrane protein isolation）属于亲和纯化蛋白质的方法，将生物素与膜蛋白相偶联，利用生物素同鸡蛋清中的亲和素以及细菌中的链亲和素高亲和力结合的特点，分离纯化生物素偶联蛋白。生物素为水溶性分子，不能通过细胞膜的脂质双分子层，因此生物素分子只能与细胞膜蛋白相结合。蛋白质分子中赖氨酸残基上的 8-氨基、半胱氨酸的巯基、蛋白质分子羧基端的天冬氨酸和谷氨酸是生物素及其衍生物的结合位点。

人们至今还不能对细胞膜中某一膜蛋白进行精确的定量，目前采用的方法大部分都是基于免疫学手段，即抗原-抗体结合的原理，对细胞特定膜蛋白进行相对定量，以比较同一细胞经过不同处理后目的蛋白含量的变化以及不同细胞间同一膜蛋白的含量差异。

生物素化膜蛋白提取法结合免疫沉淀法测定细胞分泌蛋白质含量的基本过程可分为以下几步：

A.生物素化膜蛋白提取法

弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液 PBS（pH 7.4）漂洗细胞1次；向细胞中加入 EZlink sulfo-NHS-SS-biotin 工作溶液（PBS作为溶剂，现用现配），37℃ 孵育10分钟；弃去反应液，加入新鲜配制的赖氨酸溶液，37℃ 孵育 5 分钟，以中和多余的生物素分子；弃去赖氨酸溶液，PBS清洗细胞 1 次后，加入含 1％NP-40 的细胞裂解液裂解细胞，获得含有细胞膜蛋白的提取液；使用亲和素或链亲和素琼脂糖凝胶对上述蛋白提取液进行纯化，最终获得高纯度的生物素化细胞膜蛋白。

B. 在获得细胞裂解液后，也可用目的蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀反应，获得纯度较高的目的蛋白。

1．将含有目的蛋白的细胞裂解液分成两等份，分置于两个离心管中，在一管中加入抗靶蛋白的抗体，另一管中加入对照抗体（免疫前血清或非相关抗原的单克隆抗体）。混匀后将两样品管置冰浴中平缓摇动 1h，如用杂交瘤上清作对照则需 2～3h。

2．将足量的经预处理的金黄色葡萄球菌A蛋白-sepharose 树脂加入上述抗原抗体混合物中，混匀后置冰浴中平缓摇动 1h。

3．于 4℃ 12 000r／min 离心 15～20s 收集金黄色葡萄球菌A蛋白-sepharose树脂-抗原-抗体复合物。

4．小心去除上清液，加入 1ml含 0.5mol／L NaCl 的 RIPA 缓冲液重悬沉淀，在 4℃ 摇床上放置 20min，4℃ 12 000r／min离心 20s。

5．重复步骤4两次。

6．小心去除上清液，加入 1ml含 0.15mol／L NaCl 的 RIPA 缓冲液重悬沉淀，在 4℃ 摇床上放置 20min，4℃ 12 000r／min 离心 20s。

7．小心去除上清液，加入 1ml含缓冲液 B 重悬沉淀，在4℃摇床上放置 20min，4℃ 12 000r／min 离心 20s。

8．弃去上清并小心地吸干沉淀上及管壁管盖上残留液。

9．加入 1xSDS 电泳样品缓冲液，混匀后，样品于 100℃ 煮沸 5min，12 000r／min离心 5min，上清转移到一新的离心管。

10．取所获得的免疫沉淀物进行免疫印迹分析，利用 HRP 偶联的链亲和素孵育转移膜，经化学发光获得荧光条带，根据目的蛋白分子量确定目的蛋白位置。