间接免疫碱性磷酸酶法

此方法的基本原理与 HRP-抗体间接法类似，所不同的是用 AKP 代替 HRP 标记第二抗体，将其制备成酶标记抗体。

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石蜡切片 动物血清
蛋白酶 特异性一抗 核固红 二甲苯 乙醇 树胶 PBS AKP 标记的二抗 TBS（含左旋咪唑、MgCl2）
滴管 玻片 湿盒

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1. 切片脱蜡至水，PBS 洗 3 min × 3 次。

2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。

3. 滴加正常血清，阻断 20 min（减少非特异性背录染色），吸去多余血清。

4. 滴加适当稀释的特异性一抗，37℃ 孵育 30～60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 min × 3 次。

5. 适当稀释的 AKP 标记的二抗 37℃ 孵育 30～60 min，PBS 洗 3 min×3 次。

6. 加入 0.02 mol/L（pH 9.0）TBS（内含 1 mmol/L 左旋咪唑，5 mmol/L MgCl₂）阻断内源性碱性磷酸酶。

7. 切片上滴加 50～100 μl 底物溶液（BCIP/NBT），室温中湿盒内避光显色 30 min～48 h，显色 30 min 后镜下观察，待阳性充分显示后水洗终止反应。

8. 充分水洗后用核固红复染 5 min，冲洗后系列乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

9. 结果观察，背景呈红色，阳性产物呈紫蓝色。

1. 染色结果可根据不同的显色底物而显示不同颜色，如用坚固红（FR/AS-MX）产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝（FB/AS-MX）则产物为紫绿色，而 BCIP/NB 丁为紫蓝色。

2. 特别要强调的是，FR/AS-MX 和 FB/AS-MX 底物系统产生的颜色反应产物，能溶于有剂溶剂，如乙醇、二甲苯，所以不能用树胶封片。

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