微量滴定凝集法

微量滴定凝集法（microtiter agglutination），它可利用已知抗原测定入体内抗体的水平（效价），也是诊断肠道传染病的重要方法，例如诊断伤寒、副伤寒的肥达（Widal）氏反应即为一种定量凝集反应。假如在一个病入的病程中做几次试验，其效价是逐步上升的，则表示病入患的是试验中所用微生物所引起的传染病。

血清学反应的基本组成成分除抗原与相对应的抗体外，尚需加入电解质（一般用生理盐水）。电解质的作用主要是消除抗原抗体结合物表面上的电荷，使其失去同电相斥的作用而转变为互相吸引，否则即使抗原与抗体发生结合亦不能聚合成明显的肉眼可见的反应物。

在一系列稀释的血清中（例如 1：5、1：10、1：20、1：40……），能与抗原发生明显凝集反应的最高稀释度的倒数，即为该免疫血清的效价。假如从 1：5 至 1：20 三个稀释度有凝集反应，1：40 的无凝集反应，則血清效价为 20。

1. 稀释血清（两倍稀释）

1.1 在微量滴定板上标记 10 个孔，从 1 至 10（如图 1）。

图 1　抗血清稀释图

1.2 用微量吸管（套上吸嘴）于第 1 孔中加 80 ul 生理盐水，其余各孔加 50 ul。

1.3 加 20 ul 大肠杆菌抗血清于第 1 孔中。

1.4 换一新的吸嘴，在第 1 孔中吸上、放下来回三次以充分混匀，再吸 50 ul 至第 2 孔。换吸嘴，同样在第 2 孔吸上、放下，三次后吸 50 ul 至第 3 孔，依次类推，一直稀释至第九孔，混匀后弃去 50 ul 稀释后的血清稀释度见表 1。

表 1　抗血清稀释表

2. 加菌液

每孔加大肠杆菌悬液 50 ul， 从第 10 孔（对照孔）加起，逐个向前加至第 1 孔。

3. 将滴定板按水平方向摇动，以混和孔中内容物。然后将滴定板放 35℃ 下 60 min， 再放冰箱过夜。

4. 观察结果

观察孔底有无凝集现象，阴性和对照孔的细菌沉于孔底，形成边缘整齐、光滑的小圆块，而阳性孔的孔底为边缘不整齐的凝集块。亦可借助解剖镜进行观察。当轻轻摇动滴定板后，阴性孔的圆块分散成均匀混浊的悬液，阳性孔则是细小凝集块悬浮在不混浊的液体中。