凝集反应

实验五十五 凝集反应

　　一、目的要求

　　1．了解血清学反应的基本原则。

　　2．学习玻片凝集与试管凝集的操作与观察结果的方法。

　　二、基本原理

　　凝集反应可说是经典的血清学反应，使用历史长并一直沿用至今。它分为玻片凝集法与试管凝集法两种。利用已知抗血清鉴定未知细菌常用玻片凝集法，其突出优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段。试管凝集法是一种定量法，可利用已知抗原测定人体内抗体的水平（效价），也是诊断肠道传染病的重要方法，例如诊断伤寒、副伤寒的肥达氏反应便是试管凝集反应。

　　血清学反应的基本组成成分除抗原与相对应的抗体以外，尚需加入电解质（一般用生理盐水）。电解质的作用主要是消除抗原抗体结合物表面上的电荷，使其失去同电相斥的作用而转变为互相吸引，否则即使抗原与抗体发生结合亦不能聚合成明显的肉眼可见的凝集块。

　　试管凝集反应常将试管放在一定温度的水浴箱中进行反应，因温度可促进抗原颗粒的分子运动，使细菌与细菌间互相碰撞的机会增多，从而使反应迅速发生，一般均放在37℃或56℃的水浴箱中进行反应，温度超过60℃则将引起抗体性质的损坏。

　　发生明显凝集反应（用 表示）的最高稀释度即为该免疫血清的效价。

　　三、器材

　　大肠杆菌琼脂斜面培养物，大肠杆菌悬液（每毫升含9亿个大肠杆菌的生理盐水悬液，并经60℃加温半小时），大肠杆菌免疫血清，生理盐水稀释的1：10大肠杆菌免疫血清装于小滴瓶中；

　　生理盐水，玻片，小试管，吸管，试管架，水溶箱等。

　　四、操作步骤

　　1．玻片凝集法

　　（1）在玻片的一端用滴瓶中的小滴管加一滴1：10大肠杆菌免疫血清，另一端加一滴生理盐水。

　　（2）用接种环自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，并搅匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。

　　（3）将玻片略为摆动后静置室温中，1—3分钟后即可观察到一端有凝集反应出现（图XIII-5），另一端为生理盐水对照，仍为均匀混浊。

　　2．试管凝集法

　　（1）取10支小试管，排列在试管架上。

　　（2）用带橡皮乳头的吸管吸取生理盐水，按图Ⅷ-6加0．9ml于第1试管内，其余试管各加0．5ml。

　　（3）用带橡皮乳头的1ml吸管，加0．1ml大肠杆菌免疫血清于第1试管内，仍用此吸管将管内的液体吸上与放下三次，以混合均匀。此时第1管总体积为1ml，稀释度为1：10。

　　（4）从第1管吸0．5ml稀释免疫血清注入第2管，同样方法混匀，再自第2管吸取0．5ml注入第3管，以此类推直至第9管，混匀后自第9管吸出0．5ml弃去。第10管不加血清，作为对照。

　　注意：若用一根吸管一直稀释到底，每试管在加入血清后用吸管吸放三次混匀时，第二次吸入吸管的液面高度决不能低于第一次；后一试管吸入吸管的液面高度决不能低于前一试管所吸入的高度，否则稀释度将不准确。或每一稀释度换用一支干净吸管，则不需注意高度。

　　（5）每管加入抗原（经处理的每毫升含9亿个大肠杆菌的悬液）0．5ml。用一支吸管自最后一支试管加起，逐个向前加至第1管。

　　（6）摇匀，将试管放37℃水浴箱中，4小时后取出，于室温下或冰箱内过夜。

　　（7）观察结果首先，不要摇动试管，观察管底有无凝集现象，阴性和对照试管的抗原在管底沉下，形成边缘整齐、光滑的小圆块（图XIII-7，A），阳性试管可见管底形成边缘不整齐的凝集块（图XIII-7，B）。然后轻轻摇动试管，阴性管内，圆块分散成均匀混浊的悬液；阳性管内不是均匀混浊，而是很多小凝集块悬浮于液体中。

　　结果记录方法：

　　（a）完全凝集，凝集块完全沉于管底，液体澄清，以“ ”记录。

　　（b）凝集块沉于管底，液体稍混浊，以“ ”记录。

　　（c）部分凝集，液体混浊，以“ ”记录。

　　（d）极少凝集，液体混浊，以“ ”记录。

　　（e）无变化记以“-”。

　　取“ ”的稀释度作为免疫血清的效价。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　（1）将玻片凝集结果记录于下表。

　　（2）将试管凝集结果记录于下表。

　　免疫血清效价是多少？

　　2．思考题

　　（1）血清学反应为什么要有电解质存在？所做的玻片凝集的阳性反应端有无电解质？

　　（2）稀释血清时要注意些什么？

　　（3）为什么做试管凝集试验时，要将试管放37℃水浴箱中？

　　（4）加抗原时，为什么要从最后一管加起？