50%终点法

50% 终点 (50% endpoint) 法是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做成曲线，找出造成 50% 动物、鸡胚死亡或细胞病变的终点稀释度。 LD50 (50 % Lethal dose) 为造成 50%动物或鸡胚死亡的病毒含量， ID50 (50 % Infectious dose) 即是指可造成 50%动物或鸡胚感染的剂量， CCID50 (50 % cell culture infectious dose) 为造成 50%细胞培养产生病变效应的剂量。

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病毒
含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液
细胞培养箱、细胞培养板

1. 制备细胞。

先制备好单层细胞培养物，在低倍显微镜下观察，挑选生长良好的细胞，按「传代细胞培养」法进行，将细胞单层洗涤、消化、计数。配制所需浓度的细胞悬液，细胞数目可因细胞种类而异，通常为 20 万 -30 万/ml。预先将微量细胞培养板设计好，标记；用微量加样器将细胞悬液加人微孔中，每孔 200µl。

2. 孵育细胞。

将装有细胞悬液的微孔板置于 5% CO₂ 培养箱中， 37℃培养直至细胞生长成良好的单层。

3. 接种病毒。

用含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液作为稀释液，将待测病毒作连续 10 倍稀释，如 10^-1 、 10^-2 、 10^-3 …… 10^-10 等。将培养板中的培养液全部倾弃，用微量加样器把每个稀释度的病毒液依次、对号加入各个微孔，每孔 100µl, 每个稀释度加 4 孔，同时设细胞对照孔 4 孔，不加病毒，只加稀释液，置于 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养。

4.观察结果。

于培养后的不同时间，如 18 h 、 24 h 、 36 h 等，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。表示细胞病变程度。 通观整个「单层区」，权衡总的情况，以下列符号表示其病变程度：

-：表示无细胞病变。

+：表示 1%——25% 的细胞有病变。

++: 表示 26%——50% 的细胞有病变。

+++：表示 51%——75% 的细胞有病变。

++++: 表示 76%——100% 的细胞有病变。

5.记录结果。

病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量 （50% cell culture infectious dose, CCID50）表示，即凡能使 50%（半数）细胞出现病变的最高病毒稀释度，即为 50%感染单位，简称 CCID50。有时也称其为半数组织培养感染量 （50 % tissue culture infectious dose, TCID50） 。细胞病变效应出现的时间，不同病毒不完全一样，以感染细胞的病变不再发展，而对照细胞仍完好为准。

6.计算。

（1）CCID50的计算

Reed-Muench 法计算CCID50（图片插入http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022615761176i7hmtaq3r.png）

Karber 法计算 CCID50

公式： lg CCID50< 或 LD50 、 ID50）=L+d（S- 0. 5）

L—病毒的最低稀释倍数的对数；

d—稀释系数，即组距；

s---细胞病变比值的和（不包括最低稀释度细胞病变的比值）。

图片插入：http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022616615769hmgu53nbg.png

（2）ID50 和 LD50的计算

ID50的计算与CCID50完全相同，但依接种动物或胚胎是否受感染而判定，感染与否的判定标准如家兔在接种猪瘟病毒之热反应，鸡胚胎接种新城疫病毒后血球凝集。

LD50计算方法与前两者完全相同，只是判定标准是以接种动物或胚胎是否死亡判定的。

（3）CCID50 与 PFUs 的换算

如果用同一细胞系做 CCID50试验和空斑形成单位 （PFUs） 试验， 1 ml 病毒液将会产生的PFUs 约相当于 CCID50 滴度的一半。此时的感染量为至少在单层细胞上出现 1个病毒空斑。而实际测量时，在单层细胞上可能出现 1个以上的病毒空斑，因此需要按实际测量的空斑数计算。若按数学公式推导，预期的 PFUs 将会超过 CCID50 滴度的一半。因为在 CCID50测量时，阴性代表在单层细胞上出现的空斑数为 0, 阳性代表在单层细胞上出现 1个或 1个以上的空斑。

按照泊松分布的公式 P（O） =e（-m），P（O） 代表阴性孔数的比例， m 代表 PFUs/ml, 因为任何CCID50的 P（O）=0.5，因此， e（-m） =0. 5,m= —ln 0. 5≈0. 7 。所以 0. 7 乘以CCID50的滴度即为预计的 PFUs 。

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因细胞可受多种非特异因素的影响而发生病变，所以一定要先观察对照组细胞，再观察实验组细胞，同时在观察细胞有无病变时，尚应注意下列问题：

(1) 未适应现象：初分离的病毒或实验室低温保存过久的病毒，当将其感染细胞时，往往在开始时不出现病变，但继续盲传下去即会出现病变。

(2) 无病变现象：有些病毒虽能在细胞内繁殖，但却不出现病变。

(3) 细胞带病毒现象：因很多动物及鸡胚中常常有「潜伏性病毒」而造成细胞带病毒，故在分离病毒时应特别注意这个问题。此外，支原体的污染有时亦会碰到，这是比较难处理的问题。良好的细胞单层应是细胞界限清晰，胞浆内颗粒细致均匀，无融合细胞。

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细胞病变主要有以下几种

1.整个细胞都发生改变，常表现为两种情况，其一是，胞核及整个细胞都发生肿胀、胞浆呈颗粒样变化、胞膜边缘不整齐；其二是，整个细胞发生皱缩、变圆直至碎裂脱落等。这一类的病变见于很多病毒，如肠道病毒、疮病毒、呼肠病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒等；

2.细胞聚合：如腺病毒；

3.细胞融合形成合胞体，即指多数病变细胞发生相互融合而呈「巨细胞」，但各个细胞的胞核仍可分辨，如副粘病毒、疤疹病毒；

4.细胞仅产生轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒、逆转录病毒、沙粒病毒。

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