50%溶血试验(CH50)测定补体实验
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50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清,然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标,溶血百分数作为纵坐标,可得到一个清晰的“S”形曲线。在50%溶血周围,线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动,就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示:
该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证:
假定X=加入的新鲜血清量
y=溶血的百分率,以小数表示
V=斜率
k=常数
转变成对数,上述公式就变成
材料及器材
1.稀释液(磷酸盐缓冲生理盐水)
NaCl 17g
Na2HPO4 11g
KH2PO4 0.27g
蒸馏水 100ml
使用时取此原液50ml,加90ml蒸馏水。经高压灭菌后即可使用。加入100%硫酸镁溶液1ml,可增强补体的效能。
2.绵羊红细胞悬液(1×10g/ml)
3.溶血素(2U)
2.被检血清(新鲜豚鼠血清)
3.水平离心机
4.水浴箱
5.721型分光光度计
方法:
1.浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制
取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。
取50%细胞悬液1ml,加于14ml蒸馏水中测 O.D 值为Di 按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。
2.致敏绵羊细胞
取绵羊红细胞悬液(1×102/ml)加等量的溶血素(2U/ml)。充分混合。置37℃水浴中作用30分钟,每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×108/ml致敏羊红细胞。
3.补体CH50单位测定
⑴ 按下表加样:
⑵ 将各管充分混合。置37℃水浴中60分钟(摇动1~2次,以免红细胞下沉。)
⑶从水浴中取出后,立即将各管以2000转/分离心10分钟,将各管上清液分别移于另一试管。
⑷测定各管上清液OD值(波长=540nm)
4.补体CH50单位的计算
从测定管(第1~5管)及溶血对照管(第6管)的OD值中减去红细胞对照管(第7管的OD值。再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度OD值(80/800ⅹ该管实际量ⅹ第8管OD值)。即为测定管的校正OD值。然后计算各测定管的溶血率(y值)
再计算各管的y/(1-y)值。
在双对数坐标纸上,以y/(1─y)值为横坐标,血清用量为纵坐标,得到一条直线。由于50%溶血(y=0.5)的y/(1─y)值等于1。即可由横坐标等于1的一点,在直线上求得在纵坐标上相应的截距,此即产生50%溶血的待测血清实际用量。
最后,按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性,以单位/毫升表示之。