溶血试验（CH50）法

最新修订时间：2022-02-10

材料与仪器

血清
磷酸盐缓冲液生理盐水 NaCl Na2HPO4 KH2PO4 硫酸镁溶液
水平离心机水浴箱分光光度计

步骤

一、材料准备

1. 浓度为1×10 g/ml 的绵羊红细胞配制

（1）取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。

（2）取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测值为。按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。

Vi为配制的50%细胞悬液体积，Vf为于一定量5%细胞悬液中应加入稀释的ml数：Ds为已知标准化的1×100个细胞/ml 悬液的OD₅₄₀值─0.385。

2. 致敏绵羊细胞

取绵羊红细胞悬液（1×10²/ml）加等量的溶血素（2 U/ml）。充分混合。置37℃水浴中作用30分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×10⁸/ml致敏羊红细胞。

二、操作步骤

1. 补体CH50单位测定

（1）按下表加样：

（2）将各管充分混合。置37℃水浴中60分钟（摇动1~2次，以免红细胞下沉。）

（3）从水浴中取出后，立即将各管以2000转/分离心10分钟，将各管上清液分别移于另一试管。

（4）测定各管上清液OD值（波长=540 nm）

2. 补体CH50单位的计算

（1）从测定管（第1~5管）及溶血对照管（第6管）的OD值中减去红细胞对照管（第7管）的OD值。再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度OD值（80/800ⅹ该管实际量ⅹ第8管OD值）。即为测定管的校正OD值。然后计算各测定管的溶血率（y值）

再计算各管的y/（1-y）值。

（2）在双对数坐标纸上，以y/（1─y）值为横坐标，血清用量为纵坐标，得到一条直线。由于50%溶血（y=0.5）的y/（1─y）值等于1。即可由横坐标等于1的一点，在直线上求得在纵坐标上相应的截距，此即产生50%溶血的待测血清实际用量。

（3）最后，按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性，以单位/毫升表示之。

常见问题

50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：

该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：

假定X=加入的新鲜血清量

y=溶血的百分率，以小数表示

V=斜率

k=常数

转变成对数，上述公式就变成

当以50%溶血作为终点时

代入上述公式

由于-log1＝0，，也即表示补体的50%溶血单位就是加入的新鲜血清量。

来源：丁香实验