用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析 DNA-蛋白质相互作用

含有所需结合位点的质粒DNA
35S标记的蛋白 5×结合缓冲液 10 mg mL poly (dl-dC) • poly (dl-dC)或其他的大分子载体 DNA 加样缓冲液 45%甲醇 10%乙酸 EN3HANCE (Du Pont NEN)

1) 用合适的限制性内切核酸酶切割0.5μg含有结合位点的质粒DNA (假设一个5 kb 的质粒），产生一个长为150〜700 bp的片段，这个片段的大小和内切酶切出的其他片段的大小不同。用酚抽提及乙醇沉淀纯化。

2) 建立以下15μL的结合反应：

5μL H₂O

3μL5×结合缓冲液

5μL DNA (DNA 片段各 9 nmol/L)

1μL 10 mg/mL poly (dl-dC) . poly (dl-dC)

1μL³⁵S标记的蛋白

室温下温育20 min。

设立不含有DNA及含有非特异性DNA (即缺乏结合位点）的对照反应。

3) 加5μL加样缓冲液，立刻加样到5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上。进行电泳，直至溴酚蓝接近胶的底部（根据缓冲液条件，大约需要1〜4 h),不要让胶的温度高于室温。 胶的组成及缓冲液的离子强度可作改变，并且这些改变对于检测蛋白质-DNA的相互作用可能很重要。

4) 电泳结束后，将凝胶置于45%甲醇/10%乙酸中室温下固定1 h。用EN3HANCE处理胶1 h，干胶，然后进行放射自显影。