用于蛋白质表达的标签实验

一、设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素

亲和力和可溶性的选择

在大肠埃布氏菌中生产外源蛋白时面临两个挑战: 一? 是所用蛋白质表达系统的表达水平很低; 二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体—包涵体中。弱启动子、低转录起始或稀有密码子的存在引起的表达问题都可以通过在装配过表达质粒时将矫正序列（correctivesequence) 引入基因中和使用补充了稀有 tRNA 的大肠杆菌来得到解决。

将高表达的内源性蛋白质融合在外源目标蛋白质的 N 端不仅是一个提高产量的方法，而且还可以增加目标蛋白质的可溶性: 这是可溶性标签的基本原理。

另外，亲和标签对蛋白质的纯化至关重要，它提供了多种策略使目标蛋白质结合在亲和基质上 (表 I6.1)。一些蛋白质标签既可作为亲和标签，又可作为可溶性标签。例如，谷胱甘肽-S-转移酶 (glutathione-S-tamsferase，GST) 可以提高某些蛋白质的可溶性，而可溶标签麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein,MBP) 也可用于目标蛋白质的亲和纯化。

标签的选择

亲和标签和可溶性标签在分子质量上差别非常大，因此它们给宿主细胞带来的代谢负担也有很大不同。例如，对一个具有 100 个氨基酸残基的融合有 MBP 标签 (43kDa) 的目标蛋白质来说, 要想获得 Img 的目标蛋白质就必须表达 5xng 的融合蛋白。亲和标签所要求的纯化费用也各不相同，有树脂本身的成本，也有操作过程中的花费 (再生与再使用的难易、洗脱试剂、结合能力等)。Lichty 等 (2005) 对 8 种亲和标签在纯化、产量、成本等多个方面进行了比较。目前, 也已经开展了许多类似的研究，一些综述对亲和标签 (Arnauetal.，2006b;Waugh，2005) 和可溶性标签（EspositoandChatterjee，2006) 进行了较好的总结 (Terpe，2003)，并列出了它们的优点和不足。

除去费用因素，选择哪种亲和标签通常取决于适合目标蛋白质纯化的缓冲液。组氨酸标签不适用于某些对氧化作用和蛋白质水解损伤敏感的蛋白质的纯化，因为固相金属亲和色谱（immobilizedmetalaffinitychromatographic，IMAC) 的介质不耐受还原剂或 EDTA。同样的，使用 IMAC 介质纯化对金属离子敏感的蛋白质时也要非常小心。相反，如果目标蛋白质需要变性环境或需要重折叠，那么组氨酸标签和 IMAC 纯化方法就是很好的选择。

在一些情况下，表达水平也能决定标签的选择—可溶标签如甘露糖结合蛋白 (mannan-bindingprotein,MBP)、硫氧还原蛋白标签（thioredoxin,Trx)、N 利用质 A(N-utilizationsubstanceA，NusA) 和谷胱甘肽-S-转移酶都有很强的翻译起始信号，能够驱动高水平的表达，这对于结构研究是非常有用的。另外，当需要低水平表达的时候，如当研究复合物或者生理相互作用的时候, 特异性更强的表位标签或串联标签就是更加合适的选择。

蛋白酶切割位点来去除。一些具有组氨酸标签的蛋白质已经实现了结晶，标签对蛋白质结构的影响很小或完全没有 (Carsonetal.，20 〇 7)。对某些蛋白质来说, 组氨酸标签实际上有助于蛋白质晶体的形成 [如 Smits 等 (2008)]。组氨酸标签也可以与商业来源的该标签特异性的抗体共同用于蛋白质的检测。

也有一些非标准的 6X 组氨酸形式的组氨酸标签。为了降低电荷或增加稳定性，这些标签的组氨酸序列中散布着别的氨基酸残基，如 HAT-标签和 6XHN 标签，它们能够更好地结合 Co2+-Talon 树脂（Clontech 公司）和 MAT 标签（metalaffinitytag)(SigmaAldrich 公司）

GST 标签

GST 是一种表达量很高的 26kDa 的真核蛋白质。研究显示，当融合在目标蛋白质的 N 端时，克隆自日本血吸虫 (Sc/iistosomajaponicwm) 的 GST 能够提高蛋白质的可溶性和表达量（SmithandJohnson,1988)。当 GST 位于 C 端时（图 16.1B)，其促溶能力相对较弱，但是仍然能够很好地起到亲和标签的作用。GST 可以与固定在树脂上的谷胱甘肽 (glutathione) 结合, 这可用于含有 GST 标签蛋白质的亲和纯化。融合蛋白结合在树脂上以后，可以在中性温和的条件下被游离的还原性谷胱甘肽 (10?40mrnol/L) 洗脱下来。

纯化 GST 融合蛋白所用的树脂，如谷胱甘肽琼脂糖微球 (glutathione^sepharosebead) 相对来说价格便宜, 而且有很高的载量（5?10 mgGST/mL 树脂），经过再生后可以多次使用。

要结合谷胱甘肽，GST 标签必须以正确的折叠形式存在，因此融合蛋白必须是可溶的且在非变性的条件下才能得到有效的纯化。GST 融合蛋白的表达量通常都很高，因此必须小心检测蛋白质的可溶性。对某些蛋白质来说,GST 具有可溶性标签的功能 [如 Kim 和 Lee(2008)]。GST 的底物 1-氣-2，4-二硝基苯（l-chloro-2，4dinitroben-zene,CDNB) 存在时，可以通过比色法 (c 〇 l 〇 rimetricassay) 对其进行检测（Habigetal.，1974); 当与树脂上的谷胱甘肽的结合不理想时，这个实验也可以用于监测融合蛋白中 GST 的折叠是否正确以及它的亲和力。同样可以用商业化的抗 GST 抗体来检测这个标签。

GST 标签比较大，这使其更容易被蛋白酶降解，因此 GST 融合蛋白的纯化应快速进行以使它的损失最小化。与含有组氨酸标签的蛋白质不同，可以使用含有 EDTA 的缓冲液制备 GST 标签蛋白样品以减少蛋白质降解。使用还原条件时一定要小心，因为 GST 有 4 个暴露在溶剂中的半胱氨酸，它们与蛋白质的氧化聚集有关。GST 在溶液中会形成同源二聚体，因此对寡聚蛋白来说，选择融合 GST 标签不是一个明智的选择。

GST 与谷胱甘肽的结合及洗脱都相对较慢，所以 GST 融合蛋白需要以较慢的流速上样和洗脱。因为谷胱甘肽在 280nm 处有很强的吸收，所以在洗脱时对蛋白质的监测要小心仔细地进行。

其他纯化标签

(1) 表位标签 一些可以被商业来源的抗体识别的短氨基酸序列可以作为检测和纯化蛋白质的标签使用。在分子生物领域中，添加表位标签（epitopetag) 作为追踪重组蛋白的一般做法已被广泛运用 (FritzeandAnderson,2000)，这种方法有很高的特异性，而且较小的标签可以将对目标蛋白质结构和功能的影响降到最小。这些标签通常加在 N 端或 C 端，也可以加在靶蛋白序列中（在环状结构中或结构域间的暴露于溶剂中的区域）。宿主细胞通常没有与表位标签相同的氨基酸序列，这使得对靶蛋白的检测变得容易。但是，对于纯化来说，表位标签结合的介质价格昂贵 (通常是被固定在色谱层析树脂上的单抗），与其他亲和纯化介质相比，不适合大规模的蛋白质制备。标签对应的短肽、低 PH 或其他方法 (如将标签结合所需的钙离子螯合掉，或者用盐或多元醇) 可以用来洗脱目标蛋白质，但是与其他亲和纯化的方法相比，它们中的一些方法会显得比较剧烈 (详见第 28 章）。

FLAG 标签是一种只有 8 个氨基酸残基 (DYKDDDDK) 的亲水性短肽标签，它可以用来进行目标蛋白质的检测和纯化（EinhauerandJungbauer,2001;Prickettetal.，1989)。除了可以利用一些高特异性的抗 FLAG 单抗, 还可以用 FLAG 标签中所含有的肠激酶 (enterokinase) 酶切位点（DDDK) 在纯化后彻底去除标签。FLAG 标签的一个变种是 3XFLAG 标签 (Sigma-Aldrich 公司）, 这种标签由 3 个串联重复的 FLAG 样序列组成 (Hernanetal.，2000)。其他常用的表位标签包括流感病毒血凝素表位标签 (influenzahemagglutininepitopetag,HAtag) 和 c~Myc 标签（FritzeandAnderson,2000)。

(2)S 标签 Raines 等 (2000) 对 S 标签进行过综述，利用了 RNA 酶 SCRNaseS) 的 N 端的 S-肽段 (1?20 位）与 S-蛋白（21?124 位残基）之间的紧密结合（RichardsandVithayarhil，1959)。S 标签系统使用了 S-肽段 N 端的 1?15 个氨基酸残基，还有固定在琼脂糖微球上的 S-蛋白来纯化目标蛋白质。通常来说，具有 S 标签的载体编码一个位点特异性的蛋白酶切割位点，可以通过将标签切掉或更剧烈的变性条件去破坏 S 标签和 S-蛋白之间的相互作用来进行蛋白质的洗脱。

(3)STREP-n 标签 STREP-II 标签 (WSHPQFEK) 利用了生物素（biotin) 与链亲和素（streptavidin) 之间强大的特异性相互作用（SchmidtandSkerm,1994)。这个肽标签结合在链亲和素的生物素口袋位置。Strep-Tactin 是经过了优化的能够结合 STREP-II 标签的重组链亲和素，已经用于亲和介质的制备。结合的目标蛋白质能够被较低水平 (2.5 mmol/L) 的脱硫生物素（desthiobiotin) 洗脱下来，脱硫生物素是一种生物素类似物，它能够以可逆的方式竞争性结合 Strep-Tactin(SkerraandSchmidt,2000)。洗脱条件比较温和，所用缓冲液能够含有高浓度 (达到 50 mmol/L) 的还原剂 (如 DTT 或者 i9■疏基乙醇），也能够含有螯合剂 (如 EDTA), 对于那些对氧化剂敏感的蛋白质来说，STREP-II 标签是一种极好的纯化方法。Strep-Tactin 层析法的树脂能够再生，可以反复利用数次。虽然大多数细胞提取物都含有少量的天然生物素化的宿主蛋白（biotinylatedprotem)，它们通常不会对纯化造成干扰，但是如果有必要, 可以在宿主蛋白中加人亲和素以除去生物素化的宿主蛋白（SchmidtandSkerra，2007)。也有一些研究尝试使用链亲和素/亲和素 (streptavidin/avidin) 作为融合标签，但是这些标签很难用于亲和纯化，因为这些蛋白质之间的相互作用太强以至于很难被破坏掉。

(4)CBP 标签 钙调蛋白结合肽（calmodulin-bindingpeptide,CBP) 是一种具有 26 个氨基酸残基的短肽。它来源于骨務肌肌球蛋白轻链激酶 (skeletalmusclemyosinUghtchainkinase) 的 C 端，能够特异性地结合轉调蛋白 [参考 Terpe(2003)]。固定在层析介质上的钙调蛋白（如钙调蛋白-琼脂糖凝胶）能够用来纯化具有 CBP 标签的目标蛋白质。

尽管钙调蛋白与 CBP 结合得非常紧密（亲和力在纳摩尔级），但是这种作用依赖于钙离子，结合的蛋白质可以用含有钙离子螯合剂的温和缓冲液 (如 EGTA)—步洗脱下来。因为 CBP 标签包含有蛋白激酶 A(proteinkinaseA) 的靶序列, 所以该标签的另一种用途是对融合蛋白进行 32P 同位素标记（Vaillancourtetal.,2000)。因为在真核细胞中很多内源性蛋白质能够与钙调蛋白产生互相作用，所以 CBP 标签不适用于真核表达系统。

二、可溶性标签

在重组蛋白表达中，特别是当在细菌中表达真核蛋白时，主要的瓶颈在于蛋白质的正确折叠与可溶性。一些可溶性蛋白已被作为标签用来改善目标蛋白质的折叠。这些标签应该与其他方法共同使用来促进蛋白质的折叠，如诱导后降低培养温度或者共表达伴侣蛋白（BaneyxandMujacic,2004;deMarcoetal.,2007;Sahdevetal.，2008)，为了获得较高可溶性的目标蛋白质，有必要尝试多种可溶性标签 (PelegandUnger,2008)。对于那些特别难溶的蛋白质来说，可以尝试在变性的条件下纯化蛋白质，然后再进行重折叠 (CabritaandBottomley，2004;JungbauerandKaar，2007;Qoronflehetal.，2007; 详见第 17 章)。

MBP 标签

因为 MBP 标签能够特异性地结合麦芽糖 (maltose) 和直链淀粉 (atnylose)，所以它不仅可作为一种可溶性标签 (diGmmetal,,1988)，而且能够有效地用于亲和纯化。MBP 是一个 43kDa 的大肠杆菌分泌型蛋白，它的表达水平很高并且能够提高融合在其 C 端的蛋白质的可溶性 (KapustandWaugh,1999)。近期的研究显示，融合在目标蛋白质 C 端的 MBP 也同样有效（Dysonetal.，2004)。MBP 很大，这给细胞的代谢带来很大负担，但一个高通量的测试显示，MBP 标签是最好的可溶性标签之一（DysonetaU2004;Kataevaetal.，2005)。但是, 大约有 1/4 的 MBP 融合蛋白依然是不溶的，或者在去除了 MBP 标签后蛋白质变得易于聚集^例如，我们使用大肠杆菌表达人降钙素基因相关肽受体组分蛋白（humancalcitoningene-relatedpeptide-receptorcomponentprotein,CGRP-RCP) 时发现，通过肠激酶酶切去除 N 端的 MBP 标签后出现了目标蛋白质的聚集，虽然该蛋白质已经得到了成功的表达和纯化 (Tolunetal.，2007)。每种可溶性标签的促溶效果是不同的，对于那些难溶蛋白质来说，需要尝试多种标签。硫氧还蛋白标签对于 CGRP-RCP 的表达是无效的，目标蛋白质仍然不溶。Nallamsetty 和 Waugh(2006) 认为，可溶性标签 (如 MBP 或 NusA) 在目标蛋白质的折叠中提供了帮助，去除标签后那些易聚集的目标蛋白质的可溶性由该蛋白质的自身性质决定，而不是所用的标签。

含有 MBP 标签的商业化载体具有多种标签去除位点 (NewEnglandBiolabs 公司），可以用于在胞质和周质中表达目标蛋白质。交联直链淀粉 (cross-linkedamylose) 树脂可以用来结合具有 MBP 标签的蛋白质，结合的融合蛋白能够很容易地被含有 10 mm01/1-麦芽糖的洗脱缓冲液洗脱下来。这使得具有 MBP 标签的蛋白质可以在温和的环境中经过简单的一步得到纯化。然而，淀粉亲和纯化法不能够在有还原剂或者变性环境中进行。

淀粉树脂会在一定程度上被粗提物中的淀粉酶降解，尤其是生长在丰富 LB 培养基的细胞的提取物，通过在培养基中加人葡萄糖 (〇.2%), 这种作用可以被降到最低。淀粉树脂可被再生并重复使用多次。

硫氧还蛋白标签

硫氧还蛋白（thi 〇 red 〇 xin，TrX) 是一种热稳定的、12kDa 大小的大肠杆菌胞内蛋白，该蛋白质很容易过表达，而且即使过表达至细胞总蛋白质的 40% 以上也仍然是可溶的 (LaVallieetal.，1993)，因此在重组蛋白制备中可以将其用做可溶性标签来避免包涵体的形成（LaVallieetaL,2000)。Dyson 等（2004) 的实验结果显示，Trx 标签加在目标蛋白质的 N 端可以发挥更好的作用。

硫氧还蛋白会积聚在细胞质膜的黏附位点上（BayeretaL,W87)，这使得 Tnc 融合蛋白能够经简单的渗透压或冻融处理释放出来，这提供了一种简单的初步纯化。通常会在 Tnc 标签外再添加另外的亲和标签，如组氨酸标签，以进行进一步的纯化。

NusA 标签

N 利用物质 A 转录抗终止因子（iV-utilizingsubstanceAtranscriptionantiterminationfactor，NusA) 是一个具有 495 个氨基酸残基的大蛋白质，根据一个可溶性统计模型 (statisticalsolubilitymodel)，与外源蛋白融合表达时，NusA 是大肠杆菌蛋白中可溶性最好的，这是选择其作为可溶性标签的原因（Davisetal.，1999;DeMarcoetaL，2004)。

在一些高通量的筛选测试中，NusA 作为可溶标签与 MBP 效果相似甚至好于 MBP 标签。

但是，对不同蛋白质来说会有不同的结果。NusA 标签通常与其他亲和标签一起使用，如组氨酸标签。

其他可溶性标签

目前，已经研发了一些比较小的溶解性增强标签（solubilityenhancementtag，SET) 或者溶解性增强肽 (solubilityenhancementpeptide，SEP) 标签，这些标签利用高度酸性序列来增强某些目标蛋白质的可溶性 (KatoetaL，2007;ZhangetaL，2004)。其他的一些小标签有 GBl 标签 (56 个氨基酸残基），该标签基于链球菌蛋白 G(streptococcalproteinG) 的 IgG 结合 BI 结构域 (ChengandPatel，2004;Zhouetal.，2001) 还有蛋白 A 的 IgG 结合结构域 (ZZ 结构域，116 个氨基酸残基；InouyeandSahara，2009;Rondahletal.，1992)。这些比较小的标签对制备用于核磁共振（NMR) 研究的蛋白质样品尤其有用 (KatoetaL，20 〇 7)。另夕卜，在使用蛋白质连接法 (proteinligationmethod) 创建 NMR 不可见的可溶性标签方面也取得了一些进展（Durstetal.，2008;Kobashigawaetal.，2009) 〇研究显示，融合在目标蛋白质 N 端较小的泛素样修饰物 (smallubiquitin-likemodifi?er，SUMO) 蛋白 (大约 11kDa) 能够极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性（Marblestoneetal.，2006)。在目标蛋白质纯化完成后，可用识别 SUMO 结构的 SUMO 蛋白酶 (Ulpl 的催化结构域）去除该标签（Leeetal.，2008;Panavasetal.,2009)。SUMO 融合系统也已经通过改造用于昆虫细胞和其他真核表达系统（Liuetal.,2008)。

Halo 标签是最近构建的模块化标签系统（modulartaggingsystem), 该系统具有一个大小为 34kDa 的、经过改造的卤代烧脱卤素酶 (haloalkanedehalogenase) 蛋白，它可以结合多种合成的配基（HaloTag 配基；Promega 公司）。这些配基的成分包括一个与 Halo 标签共价结合的恒定的反应性接头和一个可变的报告末端，该末端能够赋予融合蛋白许多有用的性质。因此，单一的标签可以用于活细胞的亚细胞结构成像、细胞标记和分类、亲和纯化及固相支持物上的固定（Losetal.，2008)。Ohana 等（20 〇 9) 使用了一个此类标签（HaloTag7) 与附着在琼脂糖微球上的氯烧烃接头（chloroalkanelinker) 进行了亲和纯化。因为 Halo 标签能够以一种高度特异的不可逆的方式与接头共价结合, 所以即使极低表达量的蛋白质也能够高效地结合在氯烷烃树脂上。可以使用烟草蚀纹病毒蛋白酶 (tobaccoetchvirusprotease,TEV) 将目标蛋白质洗脱下来，该酶可以切割位于 Halo 标签和靶蛋白之间的切割位点。令人惊讶的是，使用一组在大肠杆菌中难以表达的重组蛋白进行的测试表明，这种紧凑的单体 Halo 标签可以显著地提高融合蛋白的可溶性 (OhanaetaL，2009)。在这些实验中，Halo 标签的表现要大大好于 MBP，确实显示出了可溶性标签的功能。

三、标签的去除

由于蛋白标签可能会干扰目标蛋白质的正常功能，所以在完成其促进溶解或亲和纯化的作用后，标签的去除对于生物学和功能研究很有帮助，对 GST 或 MBP 这样的大标签尤其如此，尽管有一些例子显示融合了标签的蛋白质更易结晶 (Smythetal.，2003)。

大多数用来向目标蛋白质添加标签的商业化表达载体也引入了具有特殊序列的切割位点，使用重组的蛋白内切酶可以去除标签。融合蛋白的亲和纯化完成后，可以使用蛋白内切酶来处理样品以切掉标签，再过一遍亲和柱后标签与重组蛋白会被分开，收集流穿液就会得到目标蛋白质。重组蛋白内切酶通常也会带有亲和标签，这样就可以在酶切反应完成后将其轻松去除。

表 16.3 列出了一些常用的蛋白内切酶。因为肠激酶和因子 Xa 在识别位点的 C 端进行切割，这样就可以将标签和识别位点序列完整去除，因此它们对去除 N 端的标签非常有用。但是，这两种酶有时特异性不是很强, 会在位于其他碱性残基处的次级切割位点进行切割。凝血酶 (thrombin) 是另一个用于去除标签的蛋白酶，它也具有相似的次级切割位点（JennyetaL，2003;LiewetaL，2005)。用凝血酶这样的蛋白酶去除标签，尤其是对于大规模的蛋白质制备, 与其他高特异性的酶相比，它的好处在于价格低廉且效率更高。

PreScission 蛋白酶是一种具有更长的、更严谨识别序列的特异性更高的蛋白酶。它由来自于人鼻病毒-14(humanrhinovirus-14) 的蛋白酶 3C(3Cpro) 和 GS 丁标签组成，GST 标签的存在使得该酶对于移除 GST 标签非常有用。另外一种非常特异且受欢迎的蛋白酶是烟草蚀纹病毒蛋白酶（Kapustetal.,2001), 该酶切割位点后的第一个氨基酸倾向于甘氨酸 (表 16.3), 但也能够容忍其他氨基酸残基，只是切割活性会有少许下降。这使得该酶很多时候都能够将 N 端标签完整去除，在目标蛋白质上不会留下任何多余的残基 (KapustetaL，2002)。可以很容易地自己制备大量的烟草蚀纹病毒蛋白酶，通常该酶会带有一个组氨酸标签以易于纯化及在切割反应完成后将其除去（Tropeaetal.,2009)。

商业公司出售很多类型的烟草蚀纹病毒蛋白酶，它们有的带有别的亲和标签，有的具有更高的活性及稳定性。

烟草蚀纹病毒蛋白酶的一个变种是烟草脉络斑点病毒蛋白酶，其具有不同的识别序列 (Nallamsettyetal.,2004)，能够切开位于两个不同标签之间的切割位点（图 16.1C)。

外切蛋白酶也可以用来去除 N 端标签，如 TAGzyme 系统 (Arnauetal.，2006a，可从 Qiagen 公司购买）。这个方法使用/二肽氨基肽酶 I(dipeptideaminopeptidaseI,DAPase) 来逐步消化 N 端的标签直至一个二肽的终止点。已经设计出了多种类似的系统用于处理不同的序列（Arnauetal.，2006b;2008)。

完整去除 C 端的标签是比较困难的，因为大多数蛋白内切酶只在识别序列的 C 端进行切割。如果有必要完全去除标签，可以设计更加特异的酶切位点，这些位点的识别是以结构为基础的 (如 SUM? 蛋白酶;Malakhovetal.,2004)。或者利用自催化蛋白自剪接兀件（autocatalyticproteinself-splicingelement)(Inteins;SalehandPerler，2006)。这两种切割系统都加上了亲和纯化标签—SUM? 融合系统（Buttetal.,2005;Leeetal.,2008): 包括蛋白质内含子-几丁质结合结构域 (chitin-bindingdomain，CBD; 由 NewEnglandBiolabs 公司将其作为商品化的 IMPACT 系统;Chongetal.，1997) 或蛋白质内含子-聚经基丁酸醋结合蛋白（polyhydroxybutyratebinding) 和类似的蛋白质纯化系统 (Gilliesetal…?2008)。

在一些情况下，标签也可以用化学方法去除。尽管化学切割方法所用试剂价格低廉并且非常有效，但是这些反应需要剧烈的溶剂及导致变性的条件, 所以通常只用于小肽的制备。溴化氰 (CNBr) 可切割甲硫氨酸，当融合蛋白能够被设计成只有一个甲硫氨酸且位于标签和目标肽段之间，可以使用这种试剂 (D6belietal.,1998;FairlieetaL,2002)。另外一种化学切割试剂，羟胺（hydroxylamine)，能够切割天冬酰胺与甘氨酸之间的肽键 (Huetal.,2008) 〇实际应用中需要考虑的问题: 尽管在标签和目标蛋白质之间设计特异性的切割位点相对比较简单，然而标签的有效切割并不会总是发生且也难以预测。对于每一个表达构建体都要用实验检测切割效率。当使用特异性不强的酶时，还要检测可能发生在次级切割位点的切割。通常酶的用量和孵育时间需要摸索以使其最优化。切割效率的最大化对于寡聚蛋白质尤其重要，为了目标蛋白质的高产量，必须去除每一个单体上的标签 (Kenigetal.,2006)。需要切割的序列也需要在空间上能够让蛋白酶接触得到，并且相对地没有形成复杂结构; 在识别序列和目标蛋白质之间引入数个残基的间隔序列或接头序列，或者将不可能形成二级结构的序列放置在切割位点附近, 有时这都可以克服切割效率低下的问题。对于没有亲和标签的蛋白酶来说，柱上切割 (将蛋白酶注入结合有融合蛋白的亲和柱）比批式反应 (batchreaction) 更加有效。

四、结论

很多种蛋白质标签都可以用于促进重组蛋白的表达和纯化。但是，即使有如此庞大的标签库, 结构基因组学的蛋白质制备机构得到可溶性纯蛋白质的成功率也低于 50%(StructuralGenomicsConsortiumetal.,2008)。尽管这些大规模的研究项目设计出/许多很好的策略, 考虑到蛋白质折叠的多样性及它们之间不同的生物化学性质，并没有一套通用的可溶性或者亲和标签适用于所有蛋白质。标签的选择在很大程度上还是依赖于需要表达的蛋白质以及制备蛋白质的目的。在此，我们已经评述了大部分的有效的蛋白质表达标签以及与它们使用相关的问题。