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    基本方案3 成肌细胞移植到骨骼肌细胞

    相关实验：基因传递到肌肉实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    小鼠
    以 F-10 DMEM 为主要的成肌细胞生长培养基 灭菌的PBS 经灭菌的加入 PBS 中的 BSA 甲氧氟烷 乙醇
    台式离心机 纱布或棉布 有网格或分压器的玻璃房间或商用吸入室 电动剪或锋利有齿的手术剪刀 注射器

    步骤

    1. 通过反转录酶病毒转染成肌细胞（ 基本 方 案 2) 48h ，在移植前给细胞每12〜24h 换液。 2. 酶消化反转录酶病毒转染的成肌细胞并重悬于IOml F-10/DMEM-based初级成肌细 胞培养基。细胞计数。 3.350发室温离心4111 丨 11 ，去上清，用51111?88重悬，再次离心，用1111丨？63重悬并转移 至 I.5m l的小离心管中， 4500r/min离 心 30s ，去上清液，并 以 IO8 个细胞/m l的浓 度 用 0.5% BSA/PBS重悬，用移液枪吹散混匀。如果有许多小鼠要注射，请 在 Ih 内完成。 4： a. inhalation cone的使用。通过挤压一弄皱了的]int-free棉纸到一个50m l圆锥螺旋 拧盖的聚丙烯管做成一个Metofane吸入圆锥通风橱，添加几滴Metofane到棉纸 里 。抓住小鼠尾巴将小鼠提起几秒然后放进空试管中。小鼠最终将会爬进里面 避免被悬空。保持一会直到小鼠失去意识。在之后的操作中，保持小鼠的头在 试管中。 如果试管保持封闭，就可以在几次试验中不换Metofane。 注意： 此步骤应该在通风良好的地方完成。如果检测到Metofane蒸气，应该 观察合适的通风条件。 4b. inhalation chamber的使用。在通风橱中准备cham ber,用一块浸泡在Metofane中 的棉纸或纱布使之置于格子下的玻璃chamber (不要用塑料的）中，或者其他 — 种 将小鼠密闭其中的东西（ Metofane是 一种皮肤刺激性物质） 。 将一只小鼠放人in_ halation chamber中并关上盖子。等 待 Im in左右小鼠将会失去意识。将小鼠移至 inhalation cone (第4 a步）并在下面的步骤中保持小鼠的头在试管中。 5.对将注射的腿部进行去毛处理。出于快速高效不伤害皮肤的考虑，使用商业化的刮 胡刀。选择性的使用锋利的一侧，拉紧后腿向上（ 与毛生长方向相反）进行去毛处 理。如果需要可对失去意识的小鼠使用穿耳枪进行身份确认。 6•将小鼠放在一张干净的一次性bench paper上 ，用 7 0 % 乙醇消毒后腿。 7.用微量移液枪轻轻地吹散成块细胞上清液。用 50^1 Hamiliton注射器吸人细胞，按 下面的操作避免吸入气泡。 8a. 侧腓肠肌注射。将小鼠侧放并使其头远离自己，用拇指和无名指持小鼠脚，并用食 指和中指固定其腿部，标记侧腓肠肌的位置，从鼠腿的膝盖以下至踝关节背侧部。 持针以45°角慢慢地刺入皮肤，将针推进在胫骨背部的肌肉中！W2mm深。慢慢°地 注射5/^1至肌肉，几秒钟后慢慢拔出针头。 如果你想在较原始的腿部肌肉达到最大的注射量，总体积5 0 4 , IO5 个细胞/^ 效果最好。这些细胞悬液可被分为1 0 次，每腿每次注射5^1，尽管悬液可能因为针 的原因泄漏一部分。做为选择， 50jl J 悬液可以被分成尽量多的次数注射，每次约 1/^1。其结果使肌细胞与更多受体纤维组织融和，也许它将花费更多的时间并且引 起更多的潜在的肌损伤。 8b. tibialis anterior注射。将鼠背朝下放置，慢慢地将它的腿拉直。标 记 tibialisante_
    rior的位置，小腿两块骨中处于内侧且较大的一块，从膝部延伸至踝部。找到膝盖 骨 ，在膝盖向下至踝关节大概1/3处注射细胞。 . 9.将小鼠放到带有动物用草垫的笼子中，使 其 恢 复 知 觉 （ 一般在使用Metofane 2〜 5min 后） 。 备 选 方 案 2 直 接 肌 肉 注 射 质 粒 DNA 直接肌肉注射质粒D N A 的操作步骤与注射肌细胞步骤十分相似。成熟的步骤是将 质粒用P B S 浓 缩成 lmg/m l , 并 以 5〜IOiUl体积注射。 D N A 的纯化步骤是很重要的， 如果质粒被有吸附能力的柱状物纯化一一 如 Q m g e n , 它必然将去除细菌内毒素（ 可以 引起注射部位发炎） 。 Qiagen销售的试剂盒可以在注射前一周用一小块干冰对将要注射 部的肌细胞造成损伤，尽管这需要两次重复的切开和缝合。心脏中毒素和bupivacain也 可在注射前对肌细胞造成损伤。然而，大部分调查人并没有做先期的操作而只是简单地 注 射 D N A 溶液。短暂地暴露注射过的肌肉于高电压下，可以加快D N A uptake效率。 支 持 方 案 用 FA C S分 离 ^ cZ-Iabeled细 胞 F A C S 的细节见 Coligan 等 （2004) 〇 材 料 （ 标 八 的 条 目 参 见 附 录 1) 200m m o l/L 突 光 素 納 di-( H>galactopyranoside (氟脱氧葡萄糖； 100X ; 分子探 针）在 I : I (V /V ) DMSO/water (― 20°C 阴暗储存） 细胞储存在： ZacZ表 达 细 胞 （ 见基本方案2 ) 和 不 表 达 的 调 控 细 胞 V F A C S 染色缓冲液，室 温 37°C V F A C S 阻断缓冲液，冻存 V F -10-或者F-l()/D M E M 初级肌原细胞生长培养基 胶原包被组织培养皿 桌亩离心机（ 如 IEC H N -s n ) 荧光素钠激活的细胞分类机（ 如 Becton Dickinson FACStar) 注意：对 表 达 细 胞 和 不 表 达 ZacZ的调控细胞应平行地进行准备。 1. 融解 Ij ^J 200mmol/L F D G 于 9知1 水中， 37°C 水浴 2 . 取 IXlO4〜5 X 106 胰酶消化下的细胞， 4°C ， 350g 室温离心，之 后 用 IOOjUl F A C S 染色缓冲液重悬， 37°C水 浴 IOmin后 加 IOOjlJ 预热的F D G ， 37°C孵 育 lm in。 3. 加 1.8m l 冰冷的F A C S 阻断缓冲液，置冰上。尽快保持细胞冰冷分开。 4•用荧光活性细胞分选仪检测forward s c a tte r,碘化丙啶F t 和荧光素。分离细胞，弃 去 P I 阳 性 （ 死细胞）细胞和任何荧光阳性水平低于设定好的极限的细胞。如果细胞 量不能到达两个可辨别的峰之间，使用对照细胞样本去确定背景荧光水平。 5.用分选仪沉淀设定好的细胞于一个F-10-或 F-10/D M E M -based肌细胞培养基中（ 通 常 有 5 % 〜1 0 % 的细胞有最高的表达） 。加到被沉淀的细胞里的培养基的量依据期望 的分选的细胞数；尽量在适度地高密度水平分选这些细胞。 6•将分选的细胞铺在胶原质包被的皿中并转至培养箱中。

    来源：丁香实验

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