杆 状 病 毒 介 导 的 基 因 递 送 效 率 的 监 测

杆 状 病 毒 介 导 的 基 因 递 送 效 率 的 监 测

材料

试剂

细胞生长培养基（完全培养基，无血清和选择性培养基）

D-荧光素： 0.6m m o l /L 荧 光 素 溶 于 〇.6m o l/L 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 中（p H5.0)

(Sigma-Aldrich)

分装，每管 2 ml, - 20℃保存。在使用时，以：：5 用水稀释。一旦解冻，溶液在 4℃可以保存几天。

哺乳动物细胞（如人肝细胞系 H e p G 2)

磷酸盐缓冲液（P B S )

仪器

细胞培养皿

荧光计数仪

不 透 明 96 孔 板（白色或黑色)

方法

1•在 60m m 培养皿中种人 I X l O⁶个细胞， 37°C , 5%CO 2 孵育 18〜24 h 。

用于突光素监测的初始细胞数取决于实验所用的细胞系、重组杆状病毒以及荧光计数仪的检测灵敏度。

2•将病毒以 IOOpfu/个细胞的量稀释到 I m l 无血清培养基中。

没有纯化过的或是经蔗糖梯度纯化的病毒也可以用于试验。注 意 ，用传统的蚀斑形成法测定的病毒滴度只能说明在昆虫细胞中杆状病毒的感染率，所 以 ，病毒滴度并不代表其在哺乳动物细胞中的感染率。因此，我们推荐运用李时定量 P C R 来 获 得 准 确 的 病 毒 数（Loand
Chao 2004)

3 . 将培养基从培养皿中吸出，将病毒加人到培养皿中， 37°C ， 5 % C0 2, 培 养 lh 。

4.加 入 4〜5m l 含 1 0 % 胎牛血清的完全培养基， 37°C ， 5 % C 〇 2，孵 育 24〜48 h 。
不需要除去接种的病毒。若需替代转导方案，请参考第二十九章的内容。

5 . 吸去培养基，用 P B S 清洗细胞。

6.胰酶消化或是细胞刮刀刮取细胞，将细胞转人离心管。

7.1500r/m i n 离 心 3m i n ，用 IOOul 完全培养基或 P B S 重悬沉淀。

8 . 将细胞悬液转人白色或黑色的 9 6 孔板上，-每 孔 加 入 100ul 萤 光 素（pH5 . 0 ) , 快速混匀。细胞不需被裂解。

9.在加人了萤光素酶底物后，立即用荧光计数仪测量萤光素酶的酶活性。