cDNA 合成与印迹

1.密封的低密度标准培养基中 37°C 培养过夜（大部分卖方提供低密度培养基）。如果已经高密度培养过可以省去这个步骤，否则会降低活性。

2.准备重复的 96 孔板分别标记，每孔中加入 100ul 的含 100 ul/ml 氨苄的培养基。（通过氨苄抗性检查 EST 克隆）标记孔板以方便辨认。

为保存孔板，一种工作孔板被用做培养基来源（第 2~5 步）。

3.在水平微量培养板离心机上 167 g 离心 2 min, 弃上清。

4.将 96 孔多位点复制针浸入纯乙醇溶液中，火烧。冷却后挑克隆于装有 LB 的孔板中，可重复操作确保接种。

5.将孔板置于含湿润带层的 1 加仑储存袋中 37°C 培养过夜。

6.在 96 孔板中加人 Iml 含 lOOul/ml 氨节的 Super Broth 中。用多位点复制针接种到新鲜的 LB 中，盖上盖后在深孔板振荡器上 200r/min 37°C 摇 24 h。

7.每孔中加 50ul 45% 灭菌甘油，-80°C 保存。

8.预温裂解液（来自裂解试剂盒）于 37°C 直到 SDS 溶解。加入 1ml RNase 于 IOOml 重悬液中，4°C 保存。

9.每孔中加 350^1100% 变性乙醇（来自试剂盒）。盖上滤纸，小心操作以防孔板装得太满。

10.1500 g 离心 7 min。迅速倒置弃上清后换上一张干净的滤纸。要迅速，否则沉淀将浮起或移动。

11.每孔加入 100ul 含 RNase 的重悬液重悬。全部重悬后加入100ul 裂解液，轻轻混匀避免振荡染色体 DNA。

12.每孔加入 100ul 沉淀液，充分混匀后加 100ul 中和液。混勻后转移到试剂盒提供的孔板里。

13.1500 名离心 12 min。弃上清后加乙醇洗后滤出。用滤纸吸干多余的乙醇。

14.每孔中加入 500ul 70% 乙醇。迅速倒掉，吸掉多余的乙醇。将孔板放置于一干净容器中，盖上干净滤纸过夜。

15.重悬 DNA 用 200ul T low 溶液。密封让其在 4°C 溶解至少 2d 才能用。质粒保存温度为-20°C。

16.扩增 96 孔板中的 DNA，以下是 PCR 反应试剂：

17.标记薄％ 孔 PCR 板，标记供体和受体板在板的 Al 孔处以确定方向。

18.每孔中加 100 ul PCR 反应混合试剂。轻轻加人确定孔底没有气泡后，每孔中加入 Ijul 纯化的 EST 质粒模板。确定模板都加人到了 PCR 反应试剂中。

19.以下是循环体系：

20.用 2% 的琼脂糖胶电泳 2ul 的 PCR 产物，选用适当大小的分子标记（支持方案 1)。如果扩增产物已经被证实了，每个孔板只要分析一排就够了。

21.选取孔板中一排中的一个孔，用荧光测定法分析 1ul 扩增产物（支持方案 2)。

22.每孔加 200ul 乙醇/乙酸盐溶液于 96 孔 V 形底板。再每孔中加 100ul PCR 产物进行纯化，用移液枪混勻 4 次。

23.于-80°C 培养lh过夜，充分溶化。

24.4°C下2600 g 离心40 min。弃上清，留 10~20u1 在底部避免吸到沉淀。

25.用20ul 70% 乙醇洗沉淀，4℃下2600g 离心 40min。吸去上清让其在一封闭容器中风干过夜。不要用快速蒸发器。

26.每孔中加40 ul 3 X SSC, 小心密封孔板。将孔板置于加热储存袋中。将加热储存袋放置在 65°C 培养箱中 2 h，之后让其自然冷却。

27.选取孔板中一排中的一个孔分析 1 ul 提纯的重悬PCR产物用2% 的琼脂糖胶跑胶(支持方案1)。查看跑胶条带。产物于一20°C保存。

28.在转移PCR产物到玻片前，详细参看打印笔的说明。

29.用多聚L-赖氨酸包被玻片（支持方案3)。

30.将溶解的纯化 PCR 产物 167 g离心2 min。转移5~10ul PCR产物于孔板中，这将作为打印的原液。

四列直插式打印笔能产生连贯的小点，液体体积要少，打印笔深不能超过 1mm。

31.带有DNA溶液和连续沉积溶液的笔在玻片上打点。用重复的打印检查玻片上点的大小和位置。同样证实了笔能携带溶液并打点，这样简单的负荷物能产生出我们所需要的玻片。

32.如果一个或者更多的笔没有在要求的水平，重新清洗或者换另一个笔重新检测。如果所有的笔都显示了，进行全部的印记。

33.印记最后，从印记仪上取下片子，在片子边缘用玻璃刀标明编号和印记标记。并用玻璃刀刻线来标明这片子在第一块片子上的印记区域。将片子放到清洁的玻片盒，可存放一周。

34.将片子印记的一面向上放置，在一个约 24 cm X 34 cm X 5 cm Pyrex baking 皿中，盖上塑料盖。将片子用 450mJ 强度的紫外线照射。将片子转移到不锈钢架子上，并将架子置于小的玻璃容器中。

35.溶解 6.Og 琥珀酸酐于 325 ml 1-甲基-2-吡咯酮在玻璃容器中，用玻璃棒搅拌加速溶解。

注意：无菌手套应预热，并且操作；1-甲基-2-吡咯酮（一种致癌剂）应在化学防护通风橱内进行。

36.加 25 ml lmol/L 硼酸钠缓冲液到烧杯中。搅拌混合几秒钟，然后迅速倾倒到放片子^玻璃容器中。将玻璃容器放到摇床，70~90r/min 摇 20 min。

37.浸片子到沸水中。立即关掉加热器，让片子在热水中孵育 2 mm。将片子转移到 1L 盛有无水乙醇的玻璃容器中孵育 4 min。

38.转移片子到水平离心机中，167 g 离心 3 min。转移片子到一个清洁的片子盒，竖直放置过夜，准备杂交。