杂交和数据提取

最新修订时间：2022-02-10

材料与仪器

玻璃芯片
酵母 tRNA 20 X SSC 50 X Denhardt 溶液 10% SDS 0.06X SSC 洗脱缓冲液
薄壁 PCR 管热循环仪芯片杂交板水浴锅临床离心机芯片扫描仪图像分析软件

步骤

$1. 估计需要的杂交液的体积（很关键）。一般来说，按每平方毫米盖玻片面积0.0334 的量覆盖芯片（如 24m m X 50m m 玻片用40juJ)。 2.对一 40jul的杂交体系，将 C y 3-和 C y 5-标记的 c D N A 加入一个〇.2 m l 薄壁 P C R 管，加入 D E P C 处理水或者使用加速蒸发器去除水以调整至30M 1体积；不要使用高热或热照明。 3. 混合下面的物质：对于 high sample blocking 对于 high array blocking C y 5 + C y 3 探针 30^1 28^1 8m g / m l poly (d A ) IjLtl 2jLtl 4m g / m l 酵母 t R N A M 2jA 10m g / m l Cot-1 D N A ljul 0[il 20 X S S C 6|ul 6^1 50 X Denhardt 溶液 IpJ (可选） 2{A 当芯片上对照重复的 D N A 样本的剩余杂交时，用 high sample blocking配比。当在所有的芯片组件上有弥散背景或烟雾时，用 high array blocking配比。作者一般先用 high sample blocking 配比。 4.将混合物完全混匀，热循环仪上98。 (：加热 2min ， 25°C 快速冷却，加入 S D S 。 16 OOOg•离心5min。将覆盖有杂交混合液的24m m X 50m m 盖玻片与倒转的芯片接触，小心避免气泡产生。在操作实际样品前先用缓冲液和平整的载玻片练习。 5•将载玻片置于气密的芯片杂交板，加人 5^1 3X S S C 于蓄水池（如果杂交板有提供）或载玻片末端的刻线上，封闭杂交板。将此杂交板浸人65° C 水浴，杂交 16〜21h。 6. 从水浴中拿出杂交板，冷却，小心干燥。打开杂交板，移掉载玻片。 7. 将仍然黏附有盖玻片的载玻片置于盛有〇.5XSSC//〇.〇1% S D S 洗脱缓冲液的c〇plin 缸中。让盖玻片从载玻片上脱落，然后用镊子将盖玻片从◦ 叩丨以缸中取走。冲洗载玻片 2〜5min。将载玻片转入新的盛有〇.〇6X S S C 洗脱缓冲液的c 〇 pUn缸中。冲洗载玻片2〜5min。对更严格的冲洗，加入一个先用〇.5 X S S C / 〇〇1% 8 1 ) 8 的冲洗步骤或者重复正常的冲洗方法两次。 8. 转移载玻片至一载物片架上，在装有卧式转子微量滴定板的临床离心机上16^_低速迅速离心3min。不要在空气中干燥。$

$支持方案2 荧光光度法测定D N A 浓度材料（标V 的条目参见附录D V F l u o r 缓冲液 96孔板的P C R 产物 • V T E 缓冲液， p H 8 ■ \ / 5 0 j u g / m l 、 lOOjug/m l、 250jug/ml 和 5〇 Ojug/ml 的单链 D N A 标准品用于荧光检测的96孔板（如 Dynex) 12通道的多用移液器突光计（如 P E Biosystems) 装有 Microsoft Excel Software的计算机，因为荣光计没有自动分析功目旨 1. 标记一 9 6孔板用于荧光检测。用一 12通道的多用移液器加20〇4的Fluor缓冲液于每一个孔。每个孔中的P C R 产物取IjlJ 从 P C R 孔板的一排加至荧光板的一排；按荧光板 A 至 G 排的顺序。 2. 在荧光板的最后一排，加的 T E 缓冲液于第一和第七个孔，加 IjuJ的系列单链 D N A 标准品（ 50jug/ml、 100/Ltg/ml、 250jbtg/ml 和 500jug/m l)于剩下的孔中。 3. 准备一个拥有346n m 激发光和460n m 发射光的荧光计。必要时调整空白。如果荧光计不能支持自动分析，以 Excel表格形式输出数据。 4 . 以 0〜50(V g /m l d s D N A 检测标准化反应的线性度和产量。从样本和对照中减去空白值。以下列公式计算P C R 反应中d s D N A 的浓度： d s D N A (jug/ml) = P C R 样本值/平均 lOjutg/ml 值X 100。支持方案3 用多聚赖氨酸包被玻片第 1 1 章转录谱 •513 • 材料（见附录1) V 清洗液 V 左旋多聚赖氨酸溶液金牌显微镜玻片（ Becton-Dickenson ) 50slide不镑钢架子和50slide玻璃槽（ Wheaton) 25Slide 塑料架和 25slide 塑料盒（Shandon Lipshaw) 不带纸或软木塞的塑料玻片盒（如 P G C Sientific) 注意：当处理玻片时戴好无粉末的手套。如果接触到皮肤或是油脂的表面，要及时更换手套。用玻片清洗剂清理玻璃器皿和架子，该过程中必须使用超纯水。不能使用去垢剂。 1 . 把金牌显微镜玻片插人50槽玻片架上，然后将架子放入盛有500m l 清洗液的玻璃槽中。再将此槽置于平板摇床上以60r/min 的速度振荡2h 。 2 . 将清洗液倒出，然后在水下冲洗玻片3m m 。重复 4 次。 3 . 将玻片转人25槽塑料玻片架中，将其放入小的塑料盒中。将每个盒子中的玻片没人 200m l 左旋多聚赖氨酸溶液中，再于 60r/min振荡 lh。$
4 . 用水冲洗玻片3 次，将其置于水中Imin。 5 . 在 400g 离心2min，干燥玻片盒以备存放。 6 . 满1 玻片放回玻片盒中存放，并在其移置塑料玻片盒前直立过夜（不要用纸或软木塞）。于印迹前于室温下存放2 周。

来源：丁香实验