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    基本方案2 RNA 抽提和标记

    相关实验：用 cDNA 芯片分析人类基因表达实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    TRIzol 试剂 PBS 氣仿 乙醇 乙酸钠 引物 Superscript Ⅱ RNase H反转录酶 10 X low-T dNTP 混合物 EDTA TE 缓冲液
    RNeasy Maxi 试剂盒 组织匀浆机 圆底离心管 圆锥底离心管 水平离心机 薄壁 PCR 管 热循环仪 荧光扫描仪

    步骤

    la. 从组织培养收获的细胞：用 P B S 将细胞团洗两遍。 lb. 组织培养的细胞：每 2X 107 细胞中加人ImlTRIzoI, 摇匀。 lc. 冻存的组织：加 I O O m g 冻存的组织到4ml T R I z o U 然后用组织勻浆器打碎为勻 浆状。 2. 力[11/5体积的氯仿，摇 153，静置31^11。 4°(： 12 00(^离心15111丨11。弃上清，转移到 一 个 15m l 离心管，标记体积。 3. 逐滴加入等体积7 0 % 乙醇，边加边摇匀。为防止 R N A 聚集，注意每滴混匀后再加 入下一滴。 4 . 置 R N A M axi柱子于50m i 离心管，再加人2X 107〜I X l O 8 个细胞的上清液。水平 离心机2880g 离 心 5min。收集滤出液，再加到柱子中，重新离心一次。 5. 弃滤出液，向柱子中加15ml R W l 缓冲液，离心。： LOml R P E 缓冲液洗两次，后一次 离 心 lOmin。弃滤出液。 6•置柱子于新50m l 离心管上，加 I m l 经 D E P C 处理的水，静 置 Imin， 2880g•离心 5min; 不要弃滤出液。再 加 Iml经 D EPC处理的水，静 置 lmin，离 心 lOmin。 7. 将 滤 出 液 分 装 到 I.5m l 离心管中，每管40〇4。每管中再加4〇4 3m d /L 乙酸钠 (p H 5. 2 ) 和 I m l无水乙醇，混匀，室温静置15min。 4°C 12 000g 离 心 15min。 75% 乙醇洗脱两次，置 7 5 % 乙醇中一70°C 保存。 8. 4°C 12 000g 离 心 15min, 弃上清，风干，经 lmg/m l 处理的水重悬。通 过 测 定 IjlJ R N A 在 IOOjuI 50mmol/L N a O H 的 A ■的值来确定R N A 浓度。 9. 用 M icroconYM -100 500g过滤，可将其浓缩到7mg/ml以上，根据实验需要选择合 适的浓缩比例。 一 80°C储存。 10. 在 0.2ml薄 壁 P C R 管 中 进 行 R N A 引物退火。 用 2哗 〜 1锚 定 引 物 或 者 Ijug7^l poly (d T ) 12〜18 引 物 （ 两次使用相同体积)。 体系 Cy5 标记 Cy3 标记 总 R N A (〉 7m g /ml) 150〜200jug 50〜80|ug 引物 1/J.1 ¥ 经 D E P C 处理过的水 至 174 至 17jul 65°C 加 热 IOmin, 冰上冷却2min。 11. 按下列组分配制基本混合物（23M 每反应） 。当使用Superscript聚合酶时，小心避 免产生泡沫以防止酶变性。 8；^ 5X 第一链缓冲液； 4jul IOXlow-T d N T P 混合物； 4/lJ lmmol/L Cy5-或 Cy3-d U T P ; 4jnl 0. lmol/L D T T ； Ijul 3〇 U/jul RNase 抑制剂； 2|ul 200U/|ul Superscript II。 12. 加 2知1反应混合物到每个样品，混匀，点离， 42°C 孵 育 30min。再 加 ZjUlSuperscript n ，混勻， 42°C 孵育 30〜60min。 13•加 5 4 0. 5mol/L E D T A 终止反应。加 1(^1 lmol/L N a O H 65°C 孵育 60m in 水解残
    留R N A 。冷却到室温。加 2^1 lmd/L Tr1 • C1， p m .5 中和反应。 N aO H 的 纯 度 很 重 要 。微 量 的 污 染 物 或 者 长 时 间 在 玻 璃 容 器 中 保 存 都 能 降 C ^y5 染 料 分 子 ，使 溶 液 变 黄 。一 些 研 究 者 将 水 解 时 间 减 少 到 3〇min得 到 了 更好 的 结 果 。 14. 转移标记过的c D N A 到 Microcon Y M -100盒中，加 4〇〇jlJ T E 缓冲液和2〇 纯 人 Cot-I D N A 。吸管混匀后 5OOg 离心 IOmin。加 ZoojuI T E 缓冲液用 Microcon Y M - 100盒 （500g 离心8〜IOmin) 浓缩到20〜30^1。用先前的离心次数更保险，因为 加太多的水会浓缩c D N A 到滤膜上抑制它洗脱。另外的选择是使用SpeecJvac脱水 器，但不能脱水到足够干。 15. 颠倒浓缩管到一个洁净的收集管中500g 离心3min，来复苏c D N A 探针。 有 时 ，会 发 现 被 Cy5 标 记 的 cDNA凝 胶 样 蓝 色 沉 淀 物 。这 是 有 污 染 物 的 证 明 。 污 染 物 越 多 ，胶 上 得 到 的 cDNA的 片 段 越 大 。 即 使 加 热 溶 解 ，这 些 物 质 也 会 增 加 与 DNA 非 特 异 性 的 结 合 。 16. 在 T A E 缓冲液中用2〜3/^1探针跑2 % (m/V) 琼脂糖胶（6c m X 8. 5c m ，用 2m m 宽胶孔；附录 3G) 。 为得到最大的敏感性，在转载染料中使用最少的染料并且不要 加 E B 到胶或者跑胶缓冲液中。 17. 用荧光扫描仪（ 设置：红色荧光， ZOOjU m 分辨率， looov PMT) 扫胶。寻找浓的 探针smear带，从 400b p 到大于IOOObp, 和小的堆积起来的小分子质量的转录产 物。微弱的标记和明显的低分子物质说明标记较差。显示低分子物质的片段不包含 突光核酸。

    来源：丁香实验

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