为什么你抽提不好 RNA ？

RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？

RNase 真的很顽固吗？

刚涉及 RNA 抽提的新手都会听到别人说 RNase 很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。于是在配制 Tris 缓冲液时就遇到了两难的境地。Tris 缓冲液不能用 DEPC 处理，只能用 DEPC 处理过的水配制，那么在药品称量、调 pH 值等过程中 Tris 缓冲液会造到 RNase 的再次污染，所以是一个两难的境地。但是今天我要谈的是 RNase 并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。

下面的实验照片很清楚的显示了高压灭菌的效果。实验很简单，将不同含量的 RNase 用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的 RNase 一起来降解 RNA（37 度 1 小时），结果表明，当 RNase 的污染量小于 100 ng/ml 时，高压灭菌可以去除其活性。

这张照片还说明了一个问题，当你的 RNA 溶液中含有很微量的 RNase 污染时，不用过于担心，因为 RNase 对 RNA 的降解是需要时间的，更何况你的 RNA 是存放在低温下的。

DEPC 操作误区

误区一：重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。

由于 DEPC 较贵，而且书上说 DEPC 要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用 DEPC 的想法，即对含有 DEPC 的水不进行高压灭菌，从而重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。

节约本是好事，但这样的节约是无效的。为什么不能重复使用含 DEPC 的水？因为 DEPC 在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC 在 pH 6.0 和 pH 7.0 的 PBS 缓冲液中的半衰期分别约为 20 min 和 10 min，DEPC 在水中的半衰期约为 30 min。因此，重复使用含 DEPC 的水就不能保证枪头和离心管的 RNase-free。

误区二：必需长时间高压灭菌来彻底去除 DEPC。

用 DEPC 处理过的溶液，在 15－20 min 的高压灭菌后还可以闻到一股特殊的香味，因此有人认为高压灭菌去除 DEPC 不彻底，所以要延长高压灭菌的时间以完全去除 DEPC。

但是延长高压灭菌的时间并不需要，因为闻到的特殊香味不是 DEPC 的，而是 DEPC 分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的 DEPC 残留。

误区三：溶液中 DEPC 含量约高，灭活 RNase 的效果越好。

这个误区错了一半，的确，1% DEPC 能灭活高达 1000 ng/ml 的 RNase A，而 0.1% DEPC 只能灭活少于 500 ng/ml 的 RNase A。但是溶液中残留的 DEPC 副产物会抑制一些酶反应，例如 DEPC 副产物会抑制体外转录反应，因此 DEPC 含量越高，高压灭菌后的 DEPC 副产物就越多，抑制越明显。

揭示 LiCl 沉淀背后的故事

不少的文献都说，用 LiCl 沉淀 RNA 有很多好处，比如只沉淀 RNA，不会沉淀 DNA、蛋白和多糖等。但就是操作比较麻烦，比如，过夜沉淀，不能沉淀小分子 RNA 等。下面就 LiCl 沉淀方法的误区进行探讨。

误区一：LiCl 不能沉淀小分子 RNA。

很多文献都说 LiCl 沉淀的 RNA 不含小分子的 5s rRNA 和 tRNA。但，事实是这样吗？至少在我的实验中发现 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。

下面的图片更能说明 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。泳道 1 是 RNA maker，泳道 2、3、4 是用 LiCl 沉淀的 RNA。当然 LiCl 沉淀 tRNA 的效果真的不好，其原因可能是 tRNA 的高度二级结构。

误区二：LiCl 沉淀需要长时间和低温。不少文献上说 LiCl 沉淀需要 4 度、－20 度、甚至－80 度下放置 1 小时、2 小时、甚至过夜，其操作极其繁杂。但是，LiCl 沉淀真的需要长时间和低温吗？

让我们来看看下面的数据：

Lane 1, RNA marker.

Lane 2, RNA centrifutged immediately without chilling.

Lane 3, RNA chilled at -20°C for 30 minutes before centrifugation.

Lane 4, RNA incubated at 25°C for 30 minutes to test precipitation time independently of chilling.

Lane 5, RNA chilled at -20°C for 1 hour.

Lane 6, RNA incubated at 25°C for 1 hour.

图片显示放置 30 min 后，RNA 沉淀比不放置更有效（请比较泳道 2 和 3），但是比较泳道 3、4、5、6 后，你会发现在－20 度下沉淀与在 25 度下沉淀没有区别，放置 30 min 与放置 1 小时沉淀没有区别。

但是建议大家用 -20 度 ＋ 30 minutes 的沉淀方法，因为低温能降低 RNases 的活性（假设有痕量的 RNase 残留）。

小提示：任何事务有利便有弊，LiCl 沉淀与乙醇沉淀相比，它的沉淀效率稍低。数据显示 2.5 M 的 LiCl 的平均沉淀率是 74％，而乙醇则是 85％。通俗的说乙醇沉淀可以得到更多的 RNA。

本文作者系丁香园站友 @eagleeden