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    基本方案2 用普通的微阵列和单碱基延伸的方法分型 SNP

    最新修订时间：

    材料与仪器

    基因组DNA
    PCR混合液 dNTP 外切核酸酶 I 虾碱性磷酸酶 延伸混合液 杂交混合液 染色液
    S-300 柱子 GenFlex Tag 阵列 FS400 液体台 Agilent 扫描仪 GeneChip 软件

    步骤

    1. 用和多态位点相同的碱基成分（ 如 A /G 、 T /C ) 准备S N P 池，准备包括要扩增的每 个 S N P 的位点（ 可到30个 S N P 标记）特异性的正向和反向引物各1卜 mol/L的引物 混合物。 2. 根据表2. 4. 4 准备位点特异性的多重P C R 混合物到最终量为2 5 4 。根据下面的循环 条件执行P C R 。 起始步： IOmin 96°C (变性） 4 0 个循环： 30s 94°C (延伸) 40s 57°C (退火） 90s 72°C (延伸） 1 个循环： IOmin 72°C (最后延伸) 最后~■步： 无限期 4°C (保持） 3 . 为了降解和去磷酸化没用的引物和d N T P ，加 ljullOU/jul的外切核酸酶I 和 1/J 1U / W 的虾碱性磷酸酶到2 5 4 的 P C R 产物里， 37°C孵育混合Ih后， 100°C孵 育 15min 使酶失活。根据生产厂家的指导把样本放到一个S-300的柱子上，用水代替缓冲液。 4 . 照表2. 4. 5 所示准备单碱基延伸（ S B E ) 反应液，按下面的程序执行S B E 。5 * 7 8 9 起始步： 3min 96°C (起始变性) 4 5 个循环： 20s 94°C (变性） H s 58°C (退火） 最后~^步： 无限期 4°C (保持） 5. 混合所有的延伸反应液（ 每 个 25/J ) 和 30jul的 100|ug/m l 肝糖混合。加 18.75m1 8mol/L LiCl和 1125pl的预冷到一20°C 的纯乙醇混合均匀，室温下最大速度离心 15min，沉淀反应物。倒掉上清， 40°C 40min烤干样本，再用33jul的水重悬样本。 6. 100C IOmin失活准备好的样本，然后迅速放冰上2〜5min。 7. 用包含有0. 5m g /m l的乙酰基B S A 的 6XSSPE-T ， 42°C 15m in 预杂交T a g 阵列。用 12(^1的杂交混合液（ 表2.4.6)在一个烤架上以大约4〇1'/111丨11， 42°(：杂交211。 对 于 每 个 D N A 样 本 ，所 有 的 延 伸 混 合 液 （ A / G 、 A / T 、 A / C 、 G / T 和 T/C) 可以杂交到一个阵列上。 8. 用 IXSSPE-T 漂洗杂交阵列2 次，每次10s，然后在烤架上以大约40r/min， 40°C 用 IXSSPE-T 漂洗15〜20min。用 6XSSPE-T ， 22°C 在 FS400液体台清洗10次。室温 下，在烤架上以大约40r/min的转速用120W 染液染色杂交阵列15min。染色后，于 22°C 用 6XSSPE-T 在 FS400液体台清洗探针阵列10次。 9.Agilent扫描仅扫描阵列，在 530n m 和 570n m 波长处捕获信号，用 GeneChip软件将 图像文件转为数字文件，用 GeneChip软件进一步分析图像文件以给出阵列中每个探 针的亮度值

    来源：丁香实验

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