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    基本方案1 用等位基因特异性的微阵列方法进行 SNP 分型

    最新修订时间：

    材料与仪器

    GeneChip HuSNP 试剂盒 多重引物池1〜24 用生物素-T7 标记的引物 用生物素-T3 标记的引物 对照寡核苷酸B1 HuSNP Reference DNA 10 X 缓冲液Ⅱ dNTP
    扩增反应管 低速带旋转桶 滴定板的离心机 热循环仪 滴定板 微型-10微型集中器 GeneChip HuSNP 探针阵列

    步骤

    1•每个基因组D N A 样本，标记24个扩增反应管，其中一个准备装每个的24多重引物 池，用 96孔板或者排列成8 管一排的格式。每个多重引物池中取出3^1到相应的标 记的扩增反应管。 2.在前P C R 清洁房间里为28个反应准备足够的P C R 主要混合物I (表 2. 4.1)。 3•在P C R 阶段房间里，为每个基因组D N A 模板加33. 7 5 4 的 4ng/jul基因组D N A (足 够用于27个反应）到一个222. 7 5 4 量的P C R 主要混合物I 里。漩涡混合彻底。往 装有3/^1多重引物池的24 孔或管子中（ 第 1 步）各 加 9. 5^1，封好管子或板子，轻 轻地漩涡混匀，在带旋转桶的离心机上离心（ <2000r/min)。 每 12. 5一的反应液里包含5n g 的基因组D N A 和 50nmol/L S N P 特异性的引物。 4.在高拷贝的区域，对于M J 的热循环仪用下面的条件开始多重P C R 扩增反应（ 对于 Perkin-Elmer的仪器，退火50s，用或不用梯度） 。 起始步骤： 5min 95°C (变性） 30个循环： 30s 95〇C (延伸）
    55s 52°C+0.2°C/循环 (用梯度退火) 30s 720C (延伸） 5 个循环： 30s 95〇C (延伸） 55s 58〇C (退火） 30s 72〇C (延伸） 1 个循环： 7min 72〇C (最后延伸） 最后~~^步： 无限期 4°C (保持) 5•在前PCR清洁的房间里，为每个基因组DNA样本准备和标记第二组24个扩增反应 管并为28个反应准备足够的标记的PCR主要混合液n , 混合液无金牌Ampli T叫 酶 （ 表 2. 4. 2)，漩涡彻底混勻。 6•在P C R 阶段房间里立即加金牌Ampli Tag 酶到标记好的P C R 管里，分 装 22. 5|u l的 完全的主要混合液n 到新的标记好的管子/板 子 中 （ 第 5 步） ，将管子转移到主要实 验室的低拷贝的区域（ 远离热循环仪） 。 7. 用 1.0m l 的分子级水（ 无核酸酶的）装 满 96X Im l深孔微量滴定板的24个孔。 为 了 减 少 P C R 的 交 叉 污 染 ， 可 以 在 前 P C R 清 洁 的 房 间 里 用 水 装 满 一 个 深 孔 微 量 滴 定 板 ， 用 铝 箔 盖 子 盖 好 ，再 拿 到 主 要 实 验 室 。 8. 继续完成多重P C R 反 应 （ 第 2 步） ，带旋转桶的离心机上低速（ 大 约 Iooog) 离心多 重 P C R 反应板。 9. 在主要实验室的中拷贝区域，小心地移去管子的盖子，用 一 个 1〜10]^的多道移液 器和相应的tip，加 I .O 1 ^l 的 24个多重扩增反应液到装有水的板子中，用铝箔盖子紧 紧地封好孔，轻轻地漩涡混匀、离心。 1 0 . 在主要实验室的低拷贝区域，用一个1〜l〇 y 的微量移液器（ 最好的多道 的 ）分装 2. 5^1的 1 : 1000的 稀 释 液 （ 第 9 步）到标记好的装有PCR主要混合液n (第 6 步）的扩增管子/板子中。用盖子封好管子，离心。 11. 用下面的程序在热循环仪上开始标记好的PCR扩 增 反 应 （ 为 M J和 Perkin-Elmer 热循环仪优化)。 起始步： 8min 95°C (变性) 4 0 个循环： 30s 95°C (延伸） 90s 55°C (退火） 30s 72°C (延伸） 1 个循环： 7min 72°C (最后延伸) 最后一步： 无限期 4°C (保持） 12. 可选：为了确认P C R 扩增反应，在主要实验的高拷贝区域，每个反应取L5jul在 0. 4 % 的 NuSieve琼 脂 糖 （ 附录3 G ) 上分析。 所 有 的 2 4 道 都 应 该 看 见 大 约 IOObp 的 带 簇 。 13. 在主要实验室的高拷贝区域，每个PCR产物取23/J ，在两个微型-10微型集中器中 混合，室 温 13 O O O g 微 量 离 心 20min，或者直到量减少到至少1〇 倍 （ 总量小于 6〇 W)。通过反转过滤器重新获得样本， 3 000g■微量离心3min，混合浓缩物，通过 加水调整量到60W。取出3〇4用于杂交，其他保存在一2CTC
    14. ^ 据 表 2. 4. 3 给的量准备杂交混合液，如果操作多个样本，要准备多一个样品的杂 父液，只弥补吸取时的误差。 、 15. ■二广微量离心管里，混合3〇4浓 缩 的 标 记 DNA (从第13步来）到 105W 的杂交 混合液里。 95°C 5 〜 l 〇 mm变性样本后，将管子很快放到冰水浴中，冰上孵育 2mm，离心。 16. 插入二个1〇〜200y 的非移液器配套的tip到 H u S N p 探针微阵列的上面的隔膜上作 为^1^气口。用一个250； xl的非移液器配套的tip, 在样本管子里混匀杂交样本几次 (也就是重新悬浮溶液外的其他材料）并注射样本到探针阵列隔膜的底部。 17. 44°C 于 GeneChip杂交炉320或 640上杂交探针阵列过夜（ 大 约 16h)，在转架上以 4： 0 50r / m i n 的速度旋转。然 后 按 HuSNP Mapping Assay操 作 手 册 描 述 的 洗 染 和扫描微阵列。 18. 开始分析GeneChip数据，给每个探针阵列一个实验名字，产生一个,exp的文件。 扫描探针阵列后生成一■个 .dat的文件或者一个图文件。 — 、从. dat文件，软件通过每个孔划分界线自动生成一个. ce丨文件，在 包含唯一的 f 杈苷酸序列的阵列的表面一个探针孔是一个区域。软件在每个探针孔里平均像素 党度， 以产生一个• cel文件。 19. 用合适的探针阵列的GeneChip算法分析一个.cel文件，产生数据输出文件， cap 文件。 自动化的分析为那些符合标准的标记提供了分型的名称（ AA、 A B 或 者 B B ) ， 分析的最后结果是一个在• ch p 文件里的清单，可以保存成.txt文件输入到数据库 以便以后的分析。

    来源：丁香实验

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