利 用 EST2 诱 导 体 系 表 达 notch细 胞 内 结 构

利 用 EST2 诱 导 体 系 表 达 notch细 胞 内 结 构 ，确 定 其 对 分 化 的 影 响

主 要 设 备 与 试 剂

Gene PulserII 电转仪(Bio-Rad)、流式细胞仪(Becton Dickinson)、 IL-3、 G-CSF、 4-轻基三苯氧胺(OHT)、 G418、 Flag、 myc抗 体 。

实 验 方 法

( 1 ) 根 据 DDBJ/EMBL/GenBank提 供 的 基 因 构 建 notch表达载体。取 mNotch第 1751——2290位氨基酸， N 端融 合Flag标签(Sigma E urope), 测序确定融合序列编码的正确性。随 后 ERT2的 第 282〜 595位氨基酸对框(不存在移码)融 合 于 其 C 端表达。完整的可读框克隆到p5〇-X-neo载体的多克隆位点中，构建成的质粒命名为rNERTneo。空白质 粒 仅 含 基 因 用 作 对 照 转 染 。

(2) 32D 细胞培养在IM DM 维持培养基中， IL-3的浓度可刺激细胞增殖。细胞密度维 持 在 5 x l〇⁴——5xIO⁶/m 2。其支原体含量通过支原体P C R E L I S A 试剂盒进行常规监控，
并对细胞的增殖率、因子依赖性和分化度都进行了监控。
IM DM 维持培养基: IMDM、 10% 胎牛血清、鼠 IL-3条件培养液(mIL-3 CM)150U/ml。

(3) 电转逆转录病毒载体rNERTneo到 3 2 D 细胞中，条 件 是 320V、 1050uFa、 无穷大 电 阻 。 400ul常规培养基中的4xl0⁶个 细 胞 在 Bio-Rad 4 m m 电转杯中进行转染。用于G FP筛选的转染质粒量为20〜 50ug 。 转染成功后以G418抗性筛选并加入IL-3作 为 32D的维持培养因子，在软琼脂培养基中培养集落。筛选获得的细胞系以EST2抗 体 Western印迹鉴定外源基因的表达，确定稳定转染的细胞。

⑷ 加 入 O H T 到培养基中至终浓度达50nmol/L 活 化 m N^ic 32D 细胞中notch的表达。

(5)免 疫 突 光 染 色 : 培 养 在 IL-3中的32D 细胞克隆在有或无O H T 的条件下作用12 h ，随后细胞涂片、风干并在室温下以甲醇固定7 min。固定的细胞在含10% F C S 的 P B S 中室 温 孵 育 30 min，抗人雌激素受体a 的鼠单克隆抗体以1 : 100稀 释 到 含 1 % B S A 的 PBS用做一抗，细胞涂片在37T ：下与一抗孵育lh。以 1 % B S A 的 P B S 洗 涤 3 次 ，细胞再与二 抗 37T ：赙 育 lh，二抗为以1 : 100稀释到含1 % B S A 的 P B S 中的Cy3 连接的羊抗鼠IgG
抗体。随后，细胞以含1% B S A 的P B S 洗涤3 次 ，固定在荧光固定液中。显微玻片以Axiophot显微镜观察， Minolta Sprint Scan 3 5 玻片扫描仪扫描，单个图片以Microsoft PowerPoint软件确定。

(6) R B P -J 依赖的报告分析系统的转染： 32D 细 胞 以 10ug 不 同 的 notch构建载体和5ug报 道 质 粒 pGa981-6共转染。细胞在有或无50nmol/L O H T 的情况下进行培养， 24 h后收集在裂解液中。细 胞 4 ℃ 、 20 OOOg离 心 lOmin，再检测上清的萤光素酶活性。转染效率利用平行的C M V -L u c 单独转染确定，该质粒带有C M V 启动子和增强子调控的萤光素酶基因。 R B P -J 反式活化报道基因的特异性通过质粒pGa50-7的平行对照转染确定，该质粒的萤光素酶基因仅处于小珠蛋白启动子的调控之下。裂解液： P B S 、 1% Triton X-100、 lmmol/L 二硫苏糖醇(DTT)。

(7) 32D 细胞的分化诱导: 细胞在含10% F C S 的 IM DM 培养基中洗涤一次，以 2 x l〇⁵个/m l 的密度接种于分化培养基中，在选定的时间点取出部分细胞进行分析。
分化培养基： I M D M 、 10%FCS、 1000U/mlhG-CSF。

(8) May-Grunwald-Giemsa染 色 判 断 32D 细胞的分化。细胞根据以下的标准分类：① 未 分 化 的 32D 细胞(爆式集落)：嗜碱性降低(深蓝色)胞质，核单个、大、相对较圆、边缘清晰、有高密度的染色质结构、含多个核仁;②早期粒系细胞(早幼粒和中幼粒细胞):浅蓝色嗜中性粒细胞，哑铃状收缩核，很少或几乎没有核仁，粗糖的核染色质，胞质边缘浅色嗜酸性，胞质/核比例提高；③晚期粒细胞(晚幼粒细胞和嗜中性粒细胞)：带状或
分 段 核 ，边缘粗糖，聚集的染色质结构，浅 色 、嗜酸性胞核，提高的胞质/核比。通过100——200 个细胞盲选计数确定分化的比例。

(9) F A C S 分 析 ： F I T C 连 接 的 CDlIb(M a c -I)和 Gr-I 单克隆抗体用于分析32D 细胞的粒系分化水平。离心收集细胞，在 含 3 % F C S 的 P B S 中重悬。 F c 封 闭 抗 体 以 I : 100稀 释 ，在室温下添加作用5 min。随后， F I T C 标 记 的 m C D l I b 直 接 抗体或F I T C 标记的Gr-I 直 接 抗 体 或 F I T C 标记的同源匹配对照抗体以1 : 1 0 0 稀释加入，室温下暗室孵育45 min，再 洗 涤 2 次并重悬在含1 % F C S 和 lug/ml PI 的 P B S 中。 F A C S 的分析用 bectonDickinson FACScan 仪和 Cell Quest 软件来进行。

(10) 细胞的集落形成能力分析：在 有 或 无 O H T 的情况下，转 染 后 的 细 胞 m e o 或rNERTneo32D 细胞在培养 4 天后取出，按不同的细胞密度 (30 个/ml、 100 个/ml、 300 个/ml和 1000个/ml) 三等分接种在集落培养基中，其中分别添加或缺少 O H T 。 7 天后计数大于
5 0 细胞的集落。

集落培养基： I M D M 、 1 0 % mIL-3C M (150UrIL-3/ml)、 1 0 % F C S 、 0.3% 琼脂。

结 果 判 断

(1) 在 加 入 O H T 的条件下，利 用 E R T 抗体进行免疫荧光检测，结果显示 notch 转移到核内，通过报道基因的表达分析显示，这一条件下 R B P -J 是活化的。没 有 O H T 的作用 时 ，免疫荧光显示 notch 都处于胞质中，也检测不到 R B P -J 的反式活化活性。因 此 notch
的活化能进一步活化 R B P -J 发挥转录调控功能 (图 6.8)

(2) 在 维 持 自 我 更 新 的 条 件 即 仅 添 加 IL- 3 的条件下，加 入 O H T 时 32D-mNotch仍 有 少 量 分化现象 (图 6.9)。在分 化 培 养 条 件 中 ， 32D -m N o t c h 形成的集落极少，但在维 持 自 我 更 新 条 件 下 ，加 入 O H T 也有少量集落出现。因 此 notchl 的 活 化 减 少 32D细胞的自我更新同时诱导分化，它 即 使 在 存 在 IL-3 时也起作用，但 无 IL-3 时效果更明 显 。