干细胞向动物胚胎移植一 胚胎干细胞嚢胚植入构建嵌合体

干细胞向动物胚胎移植一 胚胎干细胞嚢胚植入构建嵌合体

基 本 原 理

在研究干细胞的全能性方面，最能说明问题的实验就是嵌合体的构建，利用在囊胚期动物的免疫能力尚未发育的特点，将干细胞移植到动物的囊胚中，形成聚合胚，然后发育为成熟个体，干细胞来源的细胞参与动物个体各胚层的分化，组织器官的构成，从而可以说明干细胞具有分化为全身各种细胞的能力。 目前具有这种能力的主要是胚胎干细胞 (E S 细胞)。在 2 0 世 纪 7 0 年代以来，人们已先后获得了大鼠、兔 、羊 、牛 、猪等的嵌合体。

本节主要介绍利用胚胎干细胞构建人鼠嵌合体的步骤，这将为今后通过构建嵌合体来 鉴 定 E S 细胞系或利用基因修饰 E S 细胞途径而获得转基因动物奠定基础。

主 要 设 备 与 试 剂

实 验 动 物

实验小鼠，二级。 6——8 周 龄 ，体 重 24——45 g , 饲 养 室 温 18〜 2 5 1 ，黑夜白昼时间各12 h .

主 要 试 剂
D M E M (高糖)、 F B S 、 N B C S 、 0.05% 胰蛋白酶/E D T A 、 矿物油 (mineral oil)、丝裂霉素 C(mitomycin C )、D M S O 、 明胶 (gelatin)、 P B S 、H E P E S 、0.25% 胰蛋白酶/E D T A 、 mLIF、
β-巯基乙醇、 H a n k 缓冲液。

仪 器 设 备

解剖显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、倒置相差显微镜、纤维光学入射光源、显微操作仪、显微注射操作系统、显微镜温控仪、拉针器、微锻炉、磨针器、电热鼓风干燥箱、冰藏冷冻箱、蒸汽消毒器、电热恒温板、电子天平、自动搅拌器、二氧化碳培养箱 、超净工作台、离心机、液氮罐、-70℃丈冰箱、超纯水装置。

现配现用。

操 作 步 骤

小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 的 分 离 与 培 养

1 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的分离
⑴ 对 妊 娠 13.5 天的昆明白小鼠颈椎脱臼处死， 75 %乙醇浸泡 3 min 消毒。
(2) 小 鼠 放 置 于 35m m 培养皿中在无菌条件下转人超净工作台，眼科镊交叉提起腹部皮肤，确保未夹住腹腔脏器后，用皮剪于下腹部横切一口，然后沿小鼠腹腔向两侧剪幵 ，呈 U 形切口，向上纵向翻剥皮肤，充分暴露腹膜。
(3) 更换手术器械，打开腹腔，游离并取出整个子宫，放 入 盛 P B S 的 3 5 m m 培养皿中。剪开子宫角及胎膜，将鼠胚移到另一盛满 P B S 的培养皿中。
(4) 剪去小鼠胚胎头部、尾部及红色肝脏等脏器，用 P B S 清洗 3——4 次以清除红细胞、细胞碎片等，用眼科剪将组织剪碎成约 I m m 3 的小组织块。
(5) 用 吸 管 将 组 织 移 入 50m l 离心管中，力 H 5 ml 0.05% T/E 细胞消化液，放 入 37℃、5 % C 0 2、饱和湿度的 C O 2 培养箱中 30 min，每 隔 IOmin 取出轻柔吹打 1 次 。
(6) 加 5m l 细胞培养液以终止消化，用吸管轻柔吹打分散细胞后，用 2 0 0 目滤网过滤细胞悬液，收 集 于 15m l 离心管中，低速离心 (1000r/minx5 min)。
(7) 弃上清，加 8——10m l 细胞培养液，取 200 叱 镜 下 计 数 ，调整细胞密度，取 5x 10⁵ ——
IOxlO⁵ 个/ml) , 接 种 于 75c m 2 培养瓶中。
(8) 置 C O 2 培养箱进行培养。每 2 天传代一次，待细胞传代 2〜 3 次后，即可用于制备饲养层或进行继代培养。

2 ) 胎鼠成纤维细胞的传代

(1) 吸弃瓶中旧细胞培养液。
(2) 每瓶加入 5 ml P B S ，轻柔漂洗后吸弃。
(3) 用 吸 管 取 Iml 0.05% T/E 加 入 到 75c m 2 的细胞培养瓶中，在 C O 2 培养箱中放置l——3 min
(4) 吸弃胰酶消化液。
(5) 用 5m l 的移液管吸取 5m l 的细胞培养液加入到 75c m ² 的培瓶中，轻轻吹打使贴壁的细胞全部脱落，然后在相差显微镜下观察细胞离散程度，调整吹打情况。
(6) 取离散的单细胞悬液 2OOgl/滴 ，加于细胞计数板上进行计数，调整细胞密度为5xl0⁵ ——10xl0⁵ 个/m l ，接 种 于 75cm ⁵ 的培养瓶中之后转移到 C O ² 培养箱 (5%C 0 2、 37℃ 、饱和湿度) 中培养。

3 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

(1) 细胞消化操作同传代。
(2) 离心收集细胞，吸弃上清。
(3) 用细胞冻存液重悬细胞沉淀，移入冻存管中，然后放入冻存盒移入-7 0 ℃冰箱，以 的 速 度 梯 度 降 温 ， U h 后转移至液氮中长期保存
细胞冻存液的配制：将 I m I 的 D M S O 和 3m l 的 F B S 加 入 到 6m l 的细胞培养液中配制 成 IOml 的冻存液，现配现用。

4 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的复苏

(1) 依照实验安排及所需的细胞数量计划所要复苏细胞的多少。
(2) 液氮罐中取出冻存细胞，迅速投入 37 ℃水浴。
(3) 在水浴中轻柔晃动直至冻存管内液体全部融化。
⑷将管内液体全部吸入到预先准备好的 IOmI 离心管中，用 P B S 洗 涤 2 次 ，去除对细胞有毒性的冻存液。
(5) 吸 取 IOml 的培养液重悬复苏的细胞沉淀，转 移 到 25cm ² 的培养瓶中。
(6) 标记名称、代数、时间、使用者后，转 移 到 C O 2 培养箱 (37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度) 中培养待用。

注意：在细胞冻存复苏过程中，一般的原则是慢冻快融。

5 ) 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备

⑴ 选 择 铺 满 75c m ² 细胞培养瓶底的 2——4 代小鼠胚胎成纤维细胞，吸弃旧培养液。
⑵ 在 其 中 加 入 8m l 丝裂霉素 C 液 ，然后放在 C O 2 培养箱中培养 2 h(37℃、 5% C 0 2、饱和湿度)。
⑶ 用 5m l 的移液管吸取 3 ml 0.2% 明胶缓慢加入 60m m x l 5m m 的培养皿中备用。
(4) 将已经用丝裂霉素 C 处 理 3 h 的细胞用 P B S (5 ml/次) 清洗 5 次 ，尽量除去丝裂霉
(5) 消 化 同 传 代 。
(6) 在取 2OOjiI 进行细胞记数之后。将已调整细胞密度 (5xl0⁶ 个/ml) 的单细胞悬液接种于已用明胶处理过 3 h 的培养皿中。
(7) 标 记 ，转 移 到 C 〇 2 培养箱 ( 3 7 ℃、 5 % C 0 2、饱和 湿 度 沖 培 养 ，视细胞生长状态，在 1——14 天 之 内 用 于 E S 细胞的培养。

胚 胎 干 细 胞 (E S ) 的 传 代 培 养

I) E S 细胞传代培养
(1) 选取细胞克隆生长良好、集落明显、细胞致密、细胞间无明显界限、形似鸟巢、形态未分化的集落进行初次传代。
(2) 将小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养液弃去，换 上 E S 细胞培养液，然后转移到C 〇 2 培养箱 ( 3 7℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度) 中培养待用。
(3) 将 E S 细胞培养皿 (60m m x l 5m m ) 中的旧液轻轻摇晃弃去。
⑷ 用 P B S 洗 涤 3 次 。
(5) 加 人 0.25% T / E 细胞消化液 lmi，转 移 到 3 7 ¾ 培养箱中放置 2 min。
(6) 将消化下来的 E S 细胞用胚胎干细胞培养液中和，用吸管轻柔吹打使细胞团分散为近单细胞悬液。
(7) 将细胞悬液在调整密度后接种到已经换液培养的伺养层上培养。
(8) 观察细胞形态进行传代培养、换液及冻存保种

2) E S 细胞的冻存保种及复苏

方法同小鼠胚胎成纤维细胞的冻存及复苏。

3 ) 注 射 前 E S 细胞的预处理

注射 用 E S 细胞于注射前日以 1 : 2 传代，常规消化制成单细胞悬液，接种于预先涂
布 0.2% 明 胶 的 60m m x l 5m m 培养皿上，置 C O 2 培养箱 (37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度条件)中贴壁处理 I h 以去除饲养层细胞，将 在 I h 内没有贴壁的细胞用吸管吸弃，加入新的培养 液 Iml 并用移液管轻轻吹打使贴壁的 E S 细胞全部脱离而形成细胞悬液，将其移入 Ep
管 后 置 于 备 用 。

小 鼠 胚 胎 的 收 集 及 培 养

1) 操作液

⑴ 小 鼠 冲 胚 液 ： M ₂ 液。
⑵ 囊 胚 培 养 液 ： DMEM(4.5 g/L 葡萄糖)+1〇% FBS。

2) 囊胚的获取

适 用 于 12 h 照明-12 h 黑暗的循环饲养环境 (7: 〇〇 和 19:00 改变照明)。
⑴ 约 在 15:00〜 17:00 时给小鼠腹膜内注射 5I U 的孕马血清促性腺激素 (P M S G )。
⑵ 约 46 h 以后，、腹膜内注射 5i u 的人绒毛膜促性腺激素 (hCG)。
⑶与有繁殖能力的雄性小鼠同笼过夜。
⑷ 次 日 清 早 7:00 检查阴道有无白色阴栓。
(5) 取阴栓阳性者，将检栓当天为首日作台内无菌条件下取出孕子宫，从阴道端插人装有 M 2 液 的 ImI 的一’次性注射器并注 入 M 2 液进行冲洗，即可获得发育至囊胚期的早期胚胎。

3) 嚢 胚 的 培 养

用 M 2 液将冲出来的胚胎洗 3〜 8 遍后 ，用玻璃管拉制的移卵针将其转移到用石蜡油覆盖的囊胚培养液液滴中, 胚胎培养 用 6 0 mmxl5m m 的培养皿，在 每 50ul的培养液滴中放入约 10 个胚胎，然后把
培养皿转移到 37℃、 饱和湿度、含 有 5 %C 〇 2 的 C 〇 2 培养箱中培养至显微注射。冲卵液及培养液的配方如表 5.丨所示

(2) 断 针 ：将拉好的针垂直固定在显微锻针仪上，预先在铂金丝上做一玻璃珠，将铂金丝移至毛细管内径 10〜 15um 的部位，并与针管壁接触，加热铂金丝上玻璃珠至所需温 度 ，即针壁与电热丝黏连时，停止加热，针管自动断裂。观察断口是否整齐，若整齐可留用；若不整齐，可再断一次。
(3 ) 磨针:开动电源，调节转速约 5000r/min， 使磨石上的适量超纯水不被离心掉为宜 ，然 后 在 IOx 显微镜下将断口以 45^。 接触到显微磨针仪的微磨石表面，磨 5〜 lOmin， 使断口成一个针型斜面，根据针前端的毛吸作用观察所磨针口径的大小，以 内 径 10〜 l5 Min为较好。
(4) 清 洗 ：用一段医用硅橡胶管与注射器相连构成的装置，在橡胶管端装上磨好的针 ，在 8 % 〜 10% 氢氟酸中清洗针尖端外壁 (由注射器向针内打气) 数秒，然后将针移到超纯水中清洗 10 次 ，再在无水乙醇中洗涤数次。
(5) 拔 尖 ：将磨好并清洗的针固定在显微锻针仪上，打开灯丝开关，将电压调至50〜 60V ，使铂金丝加热至微红，加热玻璃珠到微红为宜，调节操作柄移动针尖使其轻触玻璃珠，瞬间即慢慢撤回针尖并切断电源，这样可以在针尖部做出一个短但锐利的针锋，注射时可使针容易刺穿透明带和滋养层，减少对胚胎的损伤。
(6) 弯针及针的消毒处理：将拔尖的针水平放在显微锻针仪上，打开电源开关，通过 显微镜升降操作柄和测目器，观察所要弯 曲 的 部 位 ，加热使针弯曲的角度一般以20°〜 30°为宜。在使用时用紫外灯照射 I5 min，然后置于灭菌针盒中备用。

2 ) 扶持针的制作

⑴ 拉 针 ：如同拉制普通的玻璃吸管一样，双手握住外径为 1.0——1.5 mm 的厚壁毛细管的两端，将中部在微小酒精灯火焰上烧烤并两手不停旋转，待毛细管变软时，将毛细管移离火焰，同时迅速向两边拉出 5——10 cm。
(2) 断 针 ：把拉细的中间切断，这样可以制作两根扶持针。在显微镜下观察毛细管，找 到 100〜120 um叫粗细的部位，该部位与扶持针肩部的距离一般为 1.5〜 2c m 为宜，用砂轮在这个部位轻轻划痕，即可得到断口面。在显微锻针仪下观察，若断口整齐，则留用，若断口不齐，可以向拉细的扶持针肩部再断一次。
(3) 钝口 ：将断口平整的扶持针垂直固定在显微锻针仪上，打开电源开关，把断口调到离玻璃珠很近的地方，勿接触。缓慢使玻璃珠靠近断口，直至断口玻璃开始熔化，断口开始渐渐缩小，当断口直径为 70〜 80um时 ，停止加热，观察钝口，它应该是上下厚度一致、均勻、开口位于中央，否则不宜留用。
(4) 弯针及针的消毒处理：同注射针的制作。

3 ) 移胚管的制作

与制作扶持针的过程相似，移胚管一般用普通的 B D H 硬玻璃吸管在酒精灯上烧制而成。即其在酒精灯上烧的同时两手需不停转动，待玻璃吸管变软时将玻璃管移开火焰的同时迅速再向两边拉出 5〜 10c m ，用砂轮切断使内径为 130〜180 um，外 径 为 200 啤 左右 ，即 大 于 1 个胚胎而小于 2 个胚胎。移胚管开口处需加热处理成平滑钝口，目的是便于操作及尽量减少其对子宫的损伤。在弯针时，当细段靠近小酒精灯的火焰时，要保证
弯的角度达到 90°为宜

4 ) 注射针、. 扶持针、移胚管葫芦部的制作

在制作好的注射针、扶持针、移卵管肩部，可增加一细段，增加的细段可使气流量减少，针尖动作幅度降低 ，从 酿 紐 腾 动 作 的 精 度 。

E S 细 胞 的 显 微 注 射

1 ) 实验小鼠的准备与要求
为使研光顺利进行，需要定期提供相当数量的母鼠作为卵供体和代孕母鼠，以及一批相对 L 疋的正常公鼠与结扎公鼠。各类鼠的有关指标如表 5 2 所 示

(1) 胚胎供体母鼠：一般以 6——8 周龄作为超排卵供体， 4〜 6 周龄母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂。而 6 周以后母鼠产卵逐渐减少。故用超排效果会更好。一般超排较好的母鼠每只每次可以得到 20〜 3 0 个囊胚。
(2) 公 鼠 ：公鼠性成熟约在 6〜8 周，不同种系公鼠性维持时间不一，一般只使用 8〜 10个月。每只公鼠需单独饲养以免相互咬伤。刚进的公鼠需饲养 1——2 周后方可与母鼠交配。每只公鼠可与 1〜 2 只母鼠合笼交配，次日上午检查阴栓，如 2 次以上都不能使母鼠有阴栓 ，则需要更换公鼠。为保证有足够的胚胎，公鼠最好每周只交配 1〜 2 次。
(3) 受体母鼠：母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生代孕母鼠，代孕母鼠是作为显微注射后恢复囊胚的受体及其后代的养母。这种母鼠在 6 周 至 5 个月较适宜，已产过仔并成功抚育过仔鼠的假孕母鼠最理想。
⑷ 结 扎 公 鼠 ：最好选用 8〜 10 周龄的公鼠进行结扎，无种系要求。在正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要先后使 3 只以上母鼠产生阴栓且所有产生阴栓的母鼠均未怀孕；或者将结扎公鼠与超排母鼠交配，次日检完栓后杀鼠冲胚，如果卵不发育或退化，证明结扎成功。然后结扎公鼠才可以用于与母鼠交配，产生假孕母鼠。

2 ) 操作液

(I) E S 细胞培养液： E S M ;
⑵ E S 细胞消化液： 0.25% T/E ;
⑶ E S 细胞清洗液： P B S ;
⑷ 显 微 注 射 操 作 液 ： D M E M (高糖)：
15 mmol/L H E P E S
300IU/ml DNase I
2 0 % FBS
(5) 注射胚胎培养液： D M E M (髙糖)+10% F B S ;
(6) 0.2% 明胶的配制: 称取 0.2 g 明胶充分溶解于 IOOml P B S 中，151b(llb = 0453 592 kg)
高压灭菌 30 min， 保存备用。

3 ) 显微注射

(1) 显微注射系统注油：用矿物油注满显微注射系统。
(2) 安装好注射针和扶持针：将消毒好的注射针和扶持针固定到显微操作仪上，保证吸管内无气泡，调整吸管位置使之尖端聚焦。
(3) 操作滴的准备：在 6 0 _ xl5m m 塑 料 培 养 皿 中 部 制 作 相 邻 两 滴 的 囊 胚 注 射液操作滴，上面用石蜡油覆盖，置 4℃预冷处理 30m i n 后置于显微操作仪的载物台上。
(4) 把细胞移入操作滴中：用移胚管将适量 E S 细胞及胚胎分别移到两相邻的注射液滴中。
(5) 吸取合适的注射细胞，准备注射：在显微镜下仔细逐个选取所要用的注射细胞吸入注射吸管中，对健康悬浮的细胞，用注射针一次吸取 5 〇 ——1 〇〇个形态良好的 E S 细胞以便进行批量注射。之后，把吸入的 E S 细胞定位到注射针的顶端准备注射。
(6) 固定受体囊胚：吹动液体，调整囊胚方向。用扶持针固定住囊胚 I C M 处 ，或者固 定住 I C M 与滋养层交界处，让 I C M 位于囊胚的底部位置，并使囊胚尽可能降低以接近注射室的底壁从而减弱其活动性，增加其固定效果。
(7) 调整注射吸管，使之与固定吸管处于同一焦平面：试着推进注射吸管使之接近囊胚。如果固定吸管与注射吸管处于同一水平，囊胚就会出现一个凹窝。选择滋养层细胞的间隙处，定 位 ，准备注射。在此注射，既可以减少损伤又能避免生成过多的细
胞碎片。
(8) 向囊胚腔内注射：定位后，将注射吸管推进入囊胚腔。带 有 E S 细胞的注射针进入囊胚腔后，突然施加压力，使细胞释放人囊胚腔。
(9) 释放囊胚：细胞释放后，慢慢抽出注射针，通过扶持针将囊胚移到较远的地方释放。
(10) 注射完毕后将同批的胚胎移出，在胚胎操作液 M 2 液中充分洗涤后移到胚胎培养液滴中，然后转入 C O 2 培养箱 ( 3 7℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度) 中恢复培养，通常注射后的囊胚在培养 Ih 后即可恢复为正常的形态。

胚 胎 移 植

1 ) 操作液胚胎操作液： M 2 液 ；麻醉剂： 846 合剂。

2 ) 胚胎移植

(1) 注射后的囊胚经 l〜 3 h 的恢复培养后于注射的当日或次日进行移植。
(2) 将 怀 孕 3.5 天的母鼠用 846 合剂进行麻醉，用 量 为 0.03——0.05 ml/只。
(3) 用碘伏、 7 5 % 的乙醇对小鼠背部消毒。
(4) 用皮剪于背部脊柱两侧 0.5c m 处约与最后一根肋骨平行的地方剪开皮肤。
(5) 用镊子沿切口撕开皮肤和肌肉，透过腹膜可见卵巢 (橘黄色) 和脂肪垫 (白色)。
(6) 小心夹住脂肪组织，将子宫轻轻拉出固定好。
(7) 在纤维光学入射光源下，在靠近子宫角处寻找血管分布较少的部位，用 I m l 注射器的注射针头穿孔。
(8) 吸胚时可先吸入矿物油充满前端较细部分再吸胚，这样就使吸胚及转移的过程易控制。吸胚前先吸一个气泡，吸 一 段 M 2 液 ，再 吸 第 2 个气泡，然后吸胚胎，并尽量
减少 吸 M 2 液 ，吸胚完毕再吸第 3 个气泡和少量 M 2 液 。
(9) 将吸好了胚胎的移胚管插入该孔 (可明显看到注射针拔出后的出血点)，移胚管延
伸 进 子 宫 内 约 5_。将 10 枚以上形态正常的囊胚移入单侧子宫内。
(10) 将子宫等组织复位，缝合肌层和皮肤。接着行另一侧子宫的手术及移胚。
(11) 术后的代孕母鼠用 4 〇 W 的灯泡供暖至苏醒后并单独饲养，直至正常产仔。

结 果 判 断

嵌合鼠的判定及嵌合鼠的交配：移胚后受孕的代孕母鼠在妊娠第 2 0 天左右自然分
娩 ， 2 周后可以根据毛色显性判定其是否为嵌合体鼠。 一 般构建嵌合体所用 E S 细胞与受体胚胎可分别具有不同的毛色表型，如黑色与白色，由于 供 体 E S 细胞与受体胚胎来源品系有明显的毛色区别，故可以根据移植后代是否具有 E S 细胞来源的毛色显性明确判定嵌合体。以 E S 细胞来源的毛色显性所占的大致百分率来估算嵌合程度。将外观无受体品系毛色掺杂的嵌合体毛色嵌合程度认为是 100%。

注 意 事 项

(1) 在实验时间的安排上，尽可能安排在春夏，即动物运动活跃、繁殖性能和生产较旺盛的季节。
(2) 动物房的人工照明控制也是比较关键的，这一因素会影响动物的发情、妊娠。
(3) 饲养层的质量是决定 E S 细胞有效克隆的重要因素，而饲养层的质量取决于饲养层细胞的传代次数、饲养层细胞的密度、饲养层细胞的纯度及有丝分裂阻断剂的处理时间等几方面。
a.饲养层细胞的传代次数对饲养层质量的影响。胚胎成纤维细胞在体外一般可以分 裂 15〜 2 0 次 ，使用寿命可达 2〜 3 周 ， 3 —— 4 周后细胞逐渐衰老，胞质内颗粒物质增多，透明度变差，胞质内积聚大量的脂肪滴，脂肪很大时可以将胞质及核挤到偏向一侧，细胞轮廓逐渐收缩导致其贴壁不牢，最终就会从皿底脱落，收缩成一团。故细胞的传代次数对伺养层细胞的制作有很大的影响，因为细胞传过少而使杂细胞较多，所以细胞的纯度大大下降，但传代的代数过多又容易出现细胞衰老。一 般选择传代 3〜 6 次 ，生长旺盛的细胞进行实验为易。
b.饲养层细胞的密度对伺养层质量的影响。饲养层在培养皿中最好铺成单层且细胞之间无间隙，因为饲养层所产生的抑制分化因子 (LIF)—部分可以分泌到培养液中，另一部分则通过与 E S 细胞的接触而起作用，无间隙的单层细胞保证了E S 细胞与饲养层细胞的接触达到最佳效果。如果细胞接种密度过小，空隙过多而影响到饲养层的质量，那 么 接 种 的 E S 极易分化；如果接种密度过大则饲养层细胞又容易衰老。一般选择细胞铺层厚、细胞核清楚、细胞梭形结构清晰、胞质多、扁平的饲养层进行接种。 一 般需在预实验中确定针对特定培养容器的最佳的细胞数目。
C.伺养层细胞的纯度对饲养层质量的影响。细胞纯度是决定小鼠胚胎成纤维细胞质量的重要因素，贴壁生长的细胞从形态上主要分为上皮细胞型和成纤维细胞型。前者来源于外胚层及内胚层的细胞，为扁平、多角形细胞；后者来源于中胚层的组织细胞，多呈梭形，故在制作饲养层的过程中往往混杂有一定量的上皮样细胞。在制作饲养层时，将消化时间定在 5——10 min，可消除极少的死杂细胞及细胞团诽成纤维细胞的其他组织细胞)，能取得良好效果。
d.有丝分裂阻断剂的处理时间对饲养质量的影响。饲养层是经过 Y 射线照射或经丝 裂 霉 素 C 处理后用作 E S 细胞附着底物并且能产生多种营养因子的一层细胞层 。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素 C 处理，其目的是阻断 M E F 的分裂增殖 ，以避免 M E F 迅速增殖对所培养的胚胎细胞或 E S 细胞产生竞争性抑制，虽然 M E F 失去分裂能力，但仍然保持生存能力，并有同化培养液的能力，可为胚胎发育提供一些必需因子，而且可以除去体外培养环境中的毒素和代谢抑制因子。但丝裂霉素 C 为致癌剂，具很强的细胞毒性，所以用它处理时，在保证有效阻断有丝分裂的前提下，应尽可能的缩短处理时间；一 般 在 M E F 饲养层制备过程中，以 10 路/m l 丝 裂 霉 素 C 处 理 2——3 h 最为适宜，并且在操作中应用无钙、镁 的 P B S 清 洗 7 次以保证无残存的丝裂霉素 C 。
e. E S 细胞数目的影响。 E S 细 胞 每 2〜 3 天传代一次，实验选用培养第 1 天 或 第 2天的细胞，使用具有正常整倍体核型的 E S 细胞，以提高 E S 细胞嵌合于生殖细胞系的能力。一般用 1 〇 ——15 个细胞进行注射。
f. 同期发情的代孕鼠对嵌合体获得的影响。在胚胎移植中，受体和供体必须同期发 情 ，使供体胚胎与受体子宫内膜发育高度同步化才能取得良好的移植效果。这是胚胎移植能否成功的关键之一。在小鼠中，在体外培养的胚胎进行移植时 ， 一 般要求受体晚于供体 1 天见 栓 ，即子宫移植时，选用假孕怀孕 2.5 天的受体鼠。
g. 判定嵌合体方法的影响。在构建嵌合体实验中，通常以嵌合体的毛色嵌合程度来推测内脏 (尤其是种系) 的嵌合程度。有实验表明，在毛色嵌合程度较高的嵌合体中，种系嵌合的发生及种系嵌合的程度似乎是随机的，而与毛色嵌合程度无明显的相关性，这说明毛色嵌合程度与脏器嵌合程度并不完全平行，因此有必要对毛色嵌合程度较低的嵌合体进行测交分析。