密 度 梯 度 离 心 法 分 离 成 人 胰 腺 导 管 上 皮 干 细 胞

密 度 梯 度 离 心 法 分 离 成 人 胰 腺 导 管 上 皮 干 细 胞

实 验 所 需 仪 器 及 材 料

①调温低速离心机；②电子天平；③普通光学显微镜；④成人尸体供者来源的胰腺组 织 ；⑤ H B S S ;⑥ V 型胶原酶；⑦单核细胞分离(Histopaque);⑧离心管、吸管、培养板等。

成 人 胰 腺 导 管 上 皮 细 胞 的 分 离

(1)取成人尸体胰腺，于解剖显微镜下去除周围的脂肪和结缔组织，冷 Hank 缓冲液冲 洗 2 次除去血迹；

⑵ 于 胰 腺 内 灌 注 0.5m g /m l V 型胶原酶，(2 ml/g 组织)，于 3 7℃ Hank 缓冲液中(HBSS)消 化 25〜 30 min, 可见少许散落组织，并可见胰腺组织变松散；加 冷 Hank缓冲液终止消化 ，弃去消化液；以含0.5% 牛 血 清 白 蛋 白 的 代 的 HBSS 冲洗和离心(llOOr/min， 20s)2次 ，此时大部分胰腺仍呈完整团块状；加 冷 H a n k 缓冲液用吸管反复吹打至团块消失，将 其 滤 过 1 5 0 目的尼龙筛网，以除去未被消化的大块组织。

⑶ 密 度 梯 度 离 心 法 ：先将过滤后的细胞悬液与 5m l 最高密度的 Histopaque(l.119 g/ml) 混 匀 于 50m l 离心管中，再分别将密度为l. 〇 98 g/ml、 1.077 g/ml Histopaque 和 H B S S各 5m l 分别缓慢沿管壁加入于其上，代 、 1500r/m i n 离 心 20m i n 后 ，分别从三个界面(H B S S /1.077、 1.077/1.098、 1.098/1.119)和离心管底部收获细胞，胰岛多在第一和第二界面 (H B S S /1.077、1.077/1.098)，而我们所要的大量外分泌细胞和导管上皮细胞则主要位于
第三界面(1.098/1.119)和离心管底。收集细胞后， H B S S 洗 涤 2 次 (1500r/m i n 离 心 5 min)，悬浮细胞计数，备用。

成 人 胰 腺 导 管 上 皮 干 细 胞 的 培 养 扩 增 与 定 向 诱 导 分 化

实 验 所 需 仪 器 及 材 料

①超净工作台；②二氧化碳孵箱；③ 无 糖 DM EM 培养基；④胰岛素抗体；⑤胰高血糖素抗体;⑥尼克酰胺 (nicotinamide);⑦胎牛血清;⑧碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);⑨表皮细胞生长因子(EGF); ⑩ N 2 添加剂。

成 人 胰 腺 导 管 上 皮 细 胞 的 培 养 扩 增

(1) 收获的细胞按 Ix lO ⁵个/ m l的密度分别接种 3 m l 于 2 5 m l 培 养 瓶 和 I2 孔板 (每孔1m l ，加鼠尾胶原铺板的玻片)，培 养 在 含 1 0 % 胎 牛血清的D M E M 培养液中， 3 7 ℃ 、 5 %C O 2培养箱中培养，培 养 液 中 添 加 lOO U /m l 青霉 素 ， l 〇〇 U /m l 链 霉 素 ， 500 ug/l两性霉素 B 。

(2) 培 养 24 h 后换液，沉降后弃上清，加 含 b F G F 、 EGF 各 20ng/ml 和 1 % N2 添加剂 的 D M E M 培养液(不含血清) 继续培养。

(3)培 养 36 h 后弃去悬浮的细胞和胰岛; 然后用加含 b F G F 、E G F 各 20ng/m l 及 1 % N 2添加剂的D M E M 培养液(不含血清)培养，以后每 48 h 换 液 1 次 ；待形成类胰岛样细胞团后在培养基中添加浓度为 17.8 mmol/L 的葡萄糖、 l〇 m mol/L 的尼克酰胺和 2 % 胎牛血清，
继续 培 养 5 天 ，可见类胰岛团明显增多，经吸管吹打脱落，镜下手工挑选、收集类胰岛样细胞团。

检测

(1) 光镜观察: 第 1、 3、 5、 7、 9、 15、 21、 2 7 天收取培养于玻板上及培养瓶中的细胞于普通光镜及相差显微镜下观察；

⑵ 电 镜 观 察 : 第 5 、 9 、 15、 21、 2 7 天 ，部 分 细胞以 2 % 戊二醛固定，环氧树脂包埋 ， 2um 切 片 ，光镜观察，选 适 当 区 域 作 80n m 超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，电镜观察；

(3) 分别在培养24 h 、 36 h 和 1 周后取出玻片，检测巢蛋白(nestin)、胰岛素及胰高血糖素表达；

(4) 胰岛素释放实验：取分离后的胰腺消化组织悬液 lml，用双硫腙染液(双硫腙IOmg, 99.5% 乙 醇 3m l ， 2 5 氨 水 50叫)进行染色， 5 min 后显微镜下观察。镜下手工挑选胰 岛 ，每 次 4 0 个 ，共 3 次 ，每次分别放入葡萄糖含量为 3.3 mmol/L 和 16.7 mmol/L 的 2 ml
H a n k 缓冲液(含 5 % F B S )中， 3 冗 、 5 % C 0 2培养箱中培养 lh; 离心收集上清， -20℃ ：保存 。同样方法收取培养出的类胰岛样细胞团 4 0 个 。胰岛素测定采用放射免疫法。

结果

经尼克酰胺和高浓度葡萄糖等诱导分化后，细胞突起开始回缩、变 短 ，增长速度加快 ，培 养 约 2〜 3 周后细胞相互聚集形成上皮样团块，类似胰岛样组织，免疫细胞化学染色显示部分细胞呈胰岛素免疫阳性反应，少数细胞为胰高糖素免疫反应阳性。随时间延长 ，胰岛素和胰高血糖素免疫染色阳性细胞数目增多，染色增强。放射免疫法测得细胞上清有胰岛素的分泌，葡萄糖含量高的细胞上清中，胰岛素分泌量也高