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方案4 浓缩聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质点实验

相关实验:蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验

最新修订时间:

材料与仪器

包含目的蛋白的二维电泳凝胶点
丙烯酰胺混合物(30%) 琼脂糖 50g L 考马斯亮蓝染色液 脱色液 平衡缓冲液 10 X 聚丙烯酰胺电泳缓冲液 浓缩胶
巴氏滴管 聚丙烯管 Protean II xi 2-D 电泳槽(Bio-Rad) 注射器 试管 管式凝胶接合器

步骤

1.切下二维凝胶目的蛋白点,每个点分别放置于 10 ml 的聚丙烯管,用 9 ml 水重新水化。

注意不要将这些蛋白点搞混。从不同的凝胶上获得的相同的蛋白点可以在一个聚丙烯管中处理。

2.用 9 ml 水洗涤重新水化的胶块,共洗 5 次,每一次约 5 min。

3.弃去最后一次洗涤的水,加人平衡缓冲液以浸没胶块,室温下平衡胶块 lh。

4.向巴氏滴管末端滴人 5% 的琼脂糖溶液,放置片刻使其凝固。然后向巴氏滴管中滴加浓缩胶。

5.通过管式凝胶接合器将滴管嵌人 Protean Ⅱ xi2-D 电泳槽,每一块凝胶上加 0.5 ml 的水。

6.使凝胶聚合 [凝胶的详细情况,见图 6.19(a)]。弃去滴管顶端的水,加人平衡的凝胶点和平衡缓冲液(从步骤3制得)[见图 6.19(b)],凝胶块和平衡缓冲液总体积不得超过 0.5 ml。剩下的滴管体积用聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液充满。

7.室温下在 Protean Ⅱ xi2-D 电泳槽中以 250V 电压电泳,直至染料到达滴管末端。

8.停止电泳。以一个 2 ml 的注射器在滴管末端施加温和的压力,将浓缩了的凝胶自滴管取出。

9.将浓缩了的凝胶放入装有 30 ml 考马斯亮蓝染色液的 50mi 试管中,室温下染色 10?20 min。

10.以脱色液脱色。

11.将切下染色的蛋白质条带做进一步鉴定。例如,进行内部序列分析(见第 7 章),或电印迹到 PVDF 膜以后直接进行 Edman 降解(见方案 2)。

来源:丁香实验

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