材料与仪器
甲醇(HPLC级) 三氟乙酸(TFA)
双向测序柱(Agilent) 氮气供应设备 聚丙烯试管 样品加样器 上样漏斗
步骤
一、浸润层析柱
1.将准备好的两相柱的亲水段(凸向接头)移开,放在一边。
2.将柱的疏水段(凹向接头)和上样漏斗装配在一起。
3.向下按压上样漏斗并且顺时针旋转,将上样漏斗和柱的疏水段装人样品上样室中。
4.将 1ml HPLC 级的甲醇充满上样漏斗。
5.旋紧上样器的螺旋盖。
6.打开氮气(80psi) 维持足够时间,使上样漏斗变空,但应确保柱床处于浸润状态。
7.旋开螺旋盖,重复步骤④~⑥,但要用 1ml 的 2%TFA 水溶液代替甲醇。如果容许填充柱干燥,可重复此步骤。
二、准备样品溶液及上样
8.用 2%TFA 水溶液稀释样品溶液至 1~5 ml,稀释比至少为 1:1。如果样品溶液在稀释前为 1ml,则要保留上样时的流出液。
9.在柱子下面放一个干净的小烧杯或 50 ml 的聚丙烯管,收集过柱的流出液。
10.从样品点样器上去掉螺旋盖。
11.用样品溶液充满上样漏斗,使 1ml 的样品溶液在 2 min 内过柱。
一次能上多于 5 ml 的样品溶液,但需要比较长的上样时间。
12.旋紧螺旋盖,调整氮气压力为 80psi。
实验提示:保留第11 和12 步的流出液,直至样品已经测序完毕。
13.如果上样量较大,可重复步骤⑩??。
14.全部上样完成后,以 80psi 氮气干燥柱子 30s。
15.去掉螺旋盖,逆时针旋转并松开上样漏斗。
16.取出上样漏斗和与其相连的疏水柱,将二者分开。
来源:丁香实验