方案12 与质谱兼容的银染法实验

在方案 11 中介绍的银氨方法是用于检测在 SDS-PAGE 凝胶上蛋白质的最灵敏的方法之一。但是，这种方法和其他标准银染方法都不适合于质谱分析，而质谱已成为鉴定双向凝胶上蛋白质的最好方法。因为在凝胶中被质谱分析的蛋白质不能被修饰，许多通常用的敏化试剂（例如戊二醛和强氧化剂）不能使用。而且，研究者发现购买专用试剂盒有很多优点，因为其中的试剂质量对完成银染是有保证的。这样的试剂盒可从不同公司购得，如 Amersham Biosciences、Bio-Rad、Piece 等化学试剂供应公司。此处介绍的方法是基于 Yan 等描述的 Amersham Biosciences Plus One 银染试剂盒 (2000b)。他们发现这个方法适合 MALDI 和 ESI-MS 质谱，与其他银染方法（包括方案 11 中叙述的方法）相比，此法可处理少量制备样品且没有负染色效果。但是，这个过程与标准银染法相比灵敏度不够高。与 MS 兼容的银染方法，见 Shevchenko 等（1996)、Scheler 等（1998)、Gharahdagh 等（1999) 和 Sinha 等（2001)。

1.将凝胶放在含 250 ml 固定液的平皿中，在摇床上摇动 5 min。如果有多块凝胶要固定，应在单独的平皿中染色。

2.从平皿中排尽固定液，用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。不允许戴手套的手直接和凝胶接触。再加 250 ml 固定液，继续摇 15 min。

3.弃去固定液，在平皿中再次加人 250 ml 敏化液，在往复式或定轨式摇床上摇动 30 min。

4.从培养皿中排尽固定液，在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶，加足够董的去离子水来覆盖凝胶。在摇床上摇动凝胶 5 mm。

5.排尽水，重复水洗 2 次以上。

6.在步骤⑦之前 30?60 min 制备银染溶液。

对 4 个标准大小的凝胶，IL 银染溶液是足够的。

7.排尽平皿里的水，支持凝胶在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸醋薄片。在每个平皿中加 250 ml 银氨溶液在往复式或定轨式摇床上摇 20 min，摇动时间可缩短至 15 min。如有必要，应至少 15 min，不超过 20 min。

8.将银氨染色溶液倒人一个合适的废物缸中，确保不用戴手套的手接触凝胶。

9.加足够的水来覆盖凝胶。在摇床上摇 5 min。

10.排尽水，将第一次洗液倒入盛有硝酸银的废物缸。重复用 H2O 洗 2 次以上。

11.当洗凝胶时，制备显色液和终止液。将终止液放在易操作的位置以避免显色和终止之间的延迟。

12.从平皿中排尽水，在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。在培养皿中加 250 ml 反应液。在放有白纸的摇床上摇动。

白纸可提高被染色蛋白和背景之间的反差，提高决定反应终止点的准确度。

实验提示：一次不要同时显色 3 块以上的凝胶。准备显色凝胶之前在 H2O 中保存其他凝胶。合适的显色时间随每块胶的不同而不同。单独观察凝胶决定显色终止的合适时间。当蛋白质点出现黑色或小的蛋白质点变明显时，这一时间是较合适的。第一个蛋白质点出现约需 lmin。注意不要过度显色。合适的时间通常约为 5~lOmin。

13.当凝胶充分显色后，将显『色液倒人合适的废物缸内。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶，快速将 250 ml 终止溶液倒人平皿中，在摇床上摇动 IOmin0

14.弃去终止液，用 H2O 覆盖凝胶，在摇床上摇动 5 min。

15.倒掉水，重复水洗 2 次以上，准备对凝胶进行扫描分析或质谱分析。

实验提示：Gharahdaghi 等（1999) 曾报道，在凝胶消化前，脱色以除去银颗粒可能会提高质谱的效果。