方案11 银氨染色

银染聚丙烯酰胺凝胶首先由 Switzer 等引进（1979)，已迅速成为一种最普遍使用的高灵敏度蛋白质染色方法。因存在背景高、重复性不好及银镜等问题，多年来对此方法的改进较多。目前，Rabilloud 等（1994b）在文献中发现 100 多种不同的方案，但所有这些方案都包含下列基本步骤：①固定；②敏化；③银液注入；④图像显色；⑤终止反应和图像固定。

我们发现银氨染色方法可提供高灵敏度，其检测范围低至 2?4ng，处理低于 Imm 厚的凝胶时效果很好。对于不同来源的干扰，银氨染色是非常敏感的，因此操作过程必须非常洁净。水和试剂的质量较关键。对所有溶液，必须用电阻率大于 15mho/cm 的去离子水。不能用双蒸水，因其会导致不稳定结果。所有化学物质应该用尽可能高的级别。凝胶在聚合作用过程中，通过加入硫代硫酸盐可使银染结果的背景水平大大降低（Hochstrasser and Merril,1988)。

1.将凝胶（见方案 9) 放入有水的平皿中。在往复式或定轨式摇床上摇 5 min，同时制备新鲜的固定液 1。

多块凝胶的固定和染色应在分离的平皿中进行。

2.将水从平皿中排尽，在培养皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。勿用戴手套的手和凝胶直接接触。在平皿中倒人足够的固定液 1 以覆盖凝胶，在摇床上摇动 30~60 min。

3.制备新鲜的固定液 2, 将固定液 1 从平皿中排尽，用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。将足够的固定液 2 倒入平皿中覆盖凝胶。如果要在一天内完成银染，放在摇床上摇 2 h，否则，在平皿上盖一张塑料纸，在摇床上摇过夜。

如果凝胶摇动过夜，要确保在每个平皿中有足够溶液，避免凝胶干燥。

4.将固定液 2 从平皿中排尽。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。

加足够的水来覆盖凝胶，在摇床上摇动 5 min。

5.每一标准尺寸的凝胶（160 mm X 20 mm X l.5 mm) 需制备 250 ml 戊二醒敏化溶液，现用现配，保证最小必需体积，迸行以下步骤 （1） 或 （2）。

（1）保证凝胶正面朝上置于平皿中，将水从平皿中排尽，小心倾倒 250 ml 戊二醛溶液，在摇床上摇动凝胶 30 min，速度要足以使平皿中的凝胶活动自如，但不要使其从溶液中滑出。

在染色过程中知道凝胶的方位将有助于「阅读分析凝胶」。一般来说，凝胶左边是酸性末端，右边是碱性末端。虽然这不能增强凝胶的染色效果，但有助于确定在反应中的凝胶上蛋白质的位置。

（2）加 200 ml 戊二醛溶液至干净的干燥平皿中，仔细将凝胶从水中转移到戊二醛溶液中。转移凝胶时要小心，因其很易碎，应从它的一个角开始以避免在凝胶上的外来压力。在摇床上摇动 30 min。使速度足以移动平皿中的凝胶，但不要使其从溶液中滑出。

6.将戊二醛溶液排入适合的废物缸中。用水洗凝胶，将水排入盛有戊二醛的废物缸中。

7.用 H2O 将凝胶覆盖，在摇床上摇 5 min。,

8.将水排尽，重复水洗 2 次。

如果需要，洗涤次数可超过 3 次，但不能少于 2 次。

9.重复步骤⑦和⑧，将每次洗涤时间延长 30 min。

如果是 5 min 的洗涤，按实验要求，可将洗涤次数升高，超过 3 次，但不要少于 2 次。

10.在步骤11之前 30?60 min 制备银染溶液。

1L 银染溶液足够染 4 块标准尺寸凝胶。

11.从平皿中将水倒出，在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酷薄片支持凝胶，将 250 ml 银染液倒入每个平皿中。在摇床上摇动 20 min。如果必要，摇动时间可缩短 15 min，但应至少 15 min，或不超过 20 min。

12.将银染溶液倒人合适的废物缸中，确保不用戴手套的手接触凝胶。

13.用足够的水快速清洗凝胶并覆盖凝胶。将水倒人盛有硝酸银的废物缸中。

14.加足够的水来覆盖凝胶，在摇床上摇动几分钟。

15.排尽水，重复水洗这一步 2 次以上。

16.凝胶在洗涤过程中时，制备显色和终止溶液，将终止溶液倒入干净的干燥的平皿中。将平皿放在易于操作的位置以避免显色和终止之间的任何延迟。H? 将水从平皿中倒掉，在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酯薄片来支持凝胶。

在平皿中加 250 ml 显色液，在放有白纸的摇床上摇动凝胶。

白纸可增强染色的蛋白质点和背景的对比度，且有助于控制终止反应的时间点。

实验提示：一次不要多于 3 块胶。在准备显色之前在水中保存其他凝胶。合适的显色时间随每块胶的不同而不同。单独观察凝胶以决定终止反应的时间，典型的时间是当蛋白质变黑和小蛋白质点可见时。第一个蛋白质约在 Imin 后出现。小心不要过度显色，显色时间通常约为 5~lOmin。

17.当凝胶出现有效显色时，小心抬起凝胶底边快速转移到终止溶液平皿中，轻摇 1Omin。

18.弃去终止液，用 H2O 将凝胶覆盖，将凝胶放在摇床上直至其被扫描。

凝胶应尽快被扫描。来自终止液的胶中残余酸会引起蛋白质点随时间变弱。为得到准确结果，应在胶转移到水中 30 min 内扫描。