原理
蛋白质通过 IEF 进行分离之后,可进行第二向电泳,即 SDS-PAGE。本方案详细介绍了灌制均一 SDS-PAGE 凝胶的方法。均一凝胶(具完全相同的%T和%c) 对特殊分子量范围的蛋白质有较好的分离效果,因其灌制方法简单而被普遍使用。
第二向凝胶可按三种不同方式(如尺寸)方便地制备:小胶用于 7 cmIEF 第一向凝胶;标准胶用于 11 cm、13 cm 以及 18 cm IEF 第一向凝胶;大型胶用于 18~24 cm 的 IEF 第一向凝胶。这些凝胶所用的试剂见下述,但在设备上要求不同。
如果凝胶用银氨方法染色,凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色的背景水平(方案 11)(HochstrasserandMerril,1998, 见表 4.5 的注释)。
材料与仪器
凝胶灌制设备 玻璃平板 磁力搅拌子 磁力揽拌器 吸管 隔片 真空瓶 水抽真空泵或其他真空装置
步骤
1.安装玻璃板之前,用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板,以确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。
实验提示:处理玻璃板的过程中要戴手套,以减少角蛋白和其他蛋白的污染。
2.对齐两块玻璃板,在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔片。
3.用恰好足够的压力将两块玻璃板及隔片夹住,使其保持在适当的位置。将其底部立于水平面上,保证两块玻璃板底边及隔片相互齐平,锁紧夹子。
玻璃板的底边和隔片相互齐平是很重要的,这能降低灌制胶时泄漏的可能性。
4.将装配好的夹子装人灌胶架,转动旋钮以使胶框(即夹在一起的玻璃板和隔片)卡紧于支架的塑胶条上。
5.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部,不要用标记笔,因其会溶出渗入凝胶。
6.用不脱色记号笔在玻璃平板外面离上沿约0.5 cm 处作标记。
7.在灌胶之前将水加人凝胶框来确定凝胶溶液的体积。在灌胶前从凝胶框中除去全部的水,否则凝胶中丙烯酰胺的浓度会受影响。在真空瓶中配制准确体积的凝胶溶液(由表 4.5 计算),TEMED 和过硫酸铵的体积忽略不计。
8.在溶液中加一个小磁力搅拌子,用水抽真空泵抽几分钟以除去溶液中的空气,在磁力搅拌器上搅拌溶液。
虽然并非所有研究者都进行抽空气这步,但为了更佳的重复性,建议进行此步操作。
9.在瓶中加 TEMED 和过硫酸铵,轻轻搅拌至混合,不要产生气泡。
10.用吸头缓慢加入凝胶 (从一个角落滴加),加至距上沿 0.5 cm。
11.立即在凝胶上方加一薄层(100~500ul) 水饱和的正丁醇以避免凝胶暴露在氧气中,并且可使凝胶表面平整。
实验提示:第二向胶的表面应该很平,这样可更好地与第一向凝胶接触。许多研究者用双蒸水作覆盖液,但这样做可能会在凝胶上部稀释丙烯酰胺浓度。
12.让胶聚合至少 lh。
13.在聚合之后,检查每块胶是否完全聚合并且均一,同时检测胶的上表面是否水平。用双蒸水或去离子水清洗胶表面。
14.此胶可用于第二向电泳(方案 9),并可在 4°C 储存两周。
储存的胶应用胶储液覆盖,并且用塑料膜紧密缠绕好。
来源:丁香实验