方案5 第一向：蛋白质的等电聚焦电泳实验

这里所描述的分离蛋白质的两种方法都是基于蛋白质所带净电荷的多少，使用固相化的 pH 梯度凝胶进行的 IEF 技术。这些方法作为双向凝胶分离的第一向，除了利用传统的水平电泳仪进行 IPG 凝胶的等电聚焦外（方案 5 方法 A)，还能在自带的电泳槽里使用 IPG 凝胶进行等电聚焦（方案 5 方法 B)。应用这些高电压系统进行 IPG 凝胶操作要求的步骤少，可减少出错概率，避免胶条混合和杂质的污染，以及空气的接触或脲结晶的产生。因为水化和 IEF 能在一个电泳仪内连续完成，这两步操作无需人的看管，过夜即可完成。电泳仪提供的高电压使蛋白质的快速分离和准确聚焦成为可能。IPG 凝胶能在实验室中灌制（近期的综述见 Gianazza，1999)，但这很费时，也会产生其他问题。因此，以下方案所用的是购买的预制 IPG 脱水胶条（例如 Am-ershan Biosciences，Bio-Rad 和 Genomic Solution)。

一、IPG 胶条的水化

1.在新制备的或温和解冻的水化液中加 DTT 至终浓度为 2 g/L。加两性电解质载体或 IPG 缓冲液至终浓度为 0.5%~2.0%。其 pH 范围与用于分析的 IPG 胶条的 PH 范围相匹配。

2.若在水化期间将蛋白质样品加到凝胶上，则将样品用水化液稀释（或溶解）至每胶条含 Img 总蛋白。

上样量取决于实验的目的。高丰度蛋白质上样量较小，低丰度蛋白质上样量较大。

3.在 IPG 胶条的塑料支持物背面标上样品名称。

4.在溶胀槽里加入适量的水化液（见表 4.2)。将溶液缓缓加人槽中心，要避免产生飞泡，除去气泡。记录不冋样品所对应的 IPG 凝胶。可将溶胀槽标号以便确认胶条。

5.从每个胶条上除去保护膜，胶面向下放置于水化槽中。确保溶液浸没整个胶条表面。如果有必要，用镊子将胶条末端夹起，来回滑动胶条来保证其完全湿润。避免在胶条下产生气泡。如果使用 IEF 方法 B，就要确保胶条和胶槽底面的电极丝接触。

6.在上面加 1.5 ml 矿物油来防止脲沉淀。将矿物油滴人胶槽一端直至半满，接着在另一端将矿物油加满，不要让矿物油溢出。

7.室温下，胶条水化至少 6 h(最好过夜）。如果采用下述的 IEF 方法 B，要将塑料盖子盖在胶槽上面。

8.用下述的方法 A 或方法来进行蛋白质的等电聚焦。

二、蛋白质的等电聚焦（IEF)

方法 A: 在多功能水平电泳仪上进行蛋白质 IEF

1.按照说明书，装配 2D 电泳仪和温度控制仪。

2.切两根长度合适的电极丝，用 Iml 水将每个胶条浸湿，然后将多余的水分用滤纸吸干。

胶条上过多的水可能引起蛋白质的拖尾。

3.按照说明书，将 IPG 胶条和电极丝放入电泳装置中。

4.（可选）若水化时没有上样，则应按照说明书用加样杯上样。

必须通过实验决定每种类型样品的最佳上样方式。酸性 pi 值的蛋白质或使用 SDS 溶解的样品最好在阴极上样。碱性很强的蛋白质需要在阳极上样。

用加样杯上样的蛋白样品可能会在加样处产生沉淀，导致凝胶的上样量减少，为此应稀释蛋白溶液。稀释液含有脲、非离子变性剂和两性载体电解质。在开始电泳时，使用低电流，样品可缓慢进入胶条，这有助于减少样品在上样处的聚集。

5.将电极和电源连接，按所需参数对电源进行设置。

典型的 IEF 方案是使电压逐渐升高到所需聚焦电压，再维持几个小时。

聚焦电压的持续时间受许多因素影响，包括 IPG 胶条长度、PH 梯度、样品成分、上样量和水化溶液成分，而且必须通过实验确定。表 4.3 提供了分析蛋白质样品的建议条件。

在总量低于 100000 undefinedh 下很少发生过度聚焦的问题。但是，当电泳时间很长时，它可能会造成水平拖尾，特别是在凝胶的碱性末端。

6.打开电源开关开始电泳。如果可能，确保使用低电流检测。

7.在电泳结束时，关闭电源，打开电泳槽的盖子，按操作说明处理胶条。

8.用镊子夹起胶条，吸干胶条上的矿物油，放在平衡管中。对每块胶条都重复此步骤。

9.进行第二向电泳步骤（方案 6~9) 或将胶条放在试管中，储存在一 40~80°C。

胶条能储存 1 个月。

方法 B: 用 IEF 专用电泳装置进行蛋白质 IEF

1.对 IEF 的电泳装置设置程序。

典型的 IEF 方案是使电压逐渐升高到所需聚焦电压，再维持几个小时。

聚焦电压的持续时间受许多因素影响，包括 IPG 胶条长度、PH 梯度、样品成分、上样量和水化溶液成分，而且必须通过实验确定。表 4.4 提供了分析蛋白质样品的建议条件。

在总量低于 100000undefinedh 下很少发生过度聚焦的问题，但是当电泳时间很长时，它可能造成水平拖尾，特别是在凝胶的碱性末端。由于样品类型的不同，一些样品可能在电泳过程中不能达到最大电压。因此，在总 V?h 数值的基础上，对电泳条件进行设置是最好的方法，而不是通过设置时间来实现合适的聚焦。

2.盖上电泳槽的盖子，开始进行等电聚焦电泳（IEF)。

3.电泳结束后，关闭电源，打开电泳槽的盖子。

4.用镊子夹起胶条，控干胶条上的矿物油，放在平衡管中。对每块胶条都需重复此步骤。

5.进行第二向电泳（方案 6、方案 7 和方案 9)。胶条放入试管中，储存于-40~-80°C。胶条能存放 1 个月。