【资源】双向电泳之第一向等电聚焦(IEF)==非常详细
丁香园论坛
2328
双向电泳的第一向IEF 电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor 包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步 完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行12 个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出 的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。
IPG 胶条的水化和电泳
仪器：
IPGphor
试剂：
水化液（8M 尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和0 .5%IPG 缓冲液）：
水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20 度保存，但不可反复冻融)。
尿素溶液加热温度不能超过37°C， 否则蛋白会发生氨甲酰化。
实验步骤：
一. 加样品水化
1. 用样品溶解缓冲液(9M 尿素， 4%CHAPS ， 2%IPG 缓冲液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2.吸取适量(见下表)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
IPG 胶条所需水化液体积
胶条长度(cm) 每条需水化液体积~Aml~B~Kbr_~H~M~2~17 125
11 200
13 250
18 350
24 450
（如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积）
3.从酸性端（尖端）一侧剥去IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
4.IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子。
5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。
6.设置IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见下表。
IPGphor 运行条件
温度 0°C
最大电流 0.05 mA per IPG strip
样品体积 350 μl (180 mm 长 IPG strip)
电压 时间
30 V 10-12 hours(水化),
200 V 1 hour
500 V 1 hour,
500 -> 8000 V 30 min
8000 V 3 hours (IPG 4 -7); 2 hours (IPG 4-9, 3 -10L, 3-10NL)
低电压时水化， 有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。
7.IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。
8.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 °C 保存几个月。
注意：不推荐每条IPG 胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。
二、不加样品水化
(一) 标准型胶条槽：
1.用适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤3-5，水化过夜。
2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入7.5ml样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入30ml 样品。
3.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表 。
4.进行等电聚焦电泳。
5.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C 保存几个月。
(二)通用型杯上样胶条槽：
1.采用Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行IPG 胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法同步骤3-4，水化过夜。
2.将通用型杯上样胶条槽的尖端与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与IPGphor 仪器的阴极平台接触。
3.将已水化的IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与IPGphor 仪器的两个电极板接触的区域。对于7cm 和11cmIPG胶条，需将IPG 胶条的平端距离胶条槽平端大约1.5cm 处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。
4.在IPG 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽 。
5.取两个IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。
6.分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。
7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。
8.在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。
9.上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样100μl。
10.盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor 仪器的盖子。
11.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。
IPG 胶条的水化和电泳
仪器：
IPGphor
试剂：
水化液（8M 尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和0 .5%IPG 缓冲液）：
水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20 度保存，但不可反复冻融)。
尿素溶液加热温度不能超过37°C， 否则蛋白会发生氨甲酰化。
实验步骤：
一. 加样品水化
1. 用样品溶解缓冲液(9M 尿素， 4%CHAPS ， 2%IPG 缓冲液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2.吸取适量(见下表)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
IPG 胶条所需水化液体积
胶条长度(cm) 每条需水化液体积~Aml~B~Kbr_~H~M~2~17 125
11 200
13 250
18 350
24 450
（如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积）
3.从酸性端（尖端）一侧剥去IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
4.IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子。
5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。
6.设置IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见下表。
IPGphor 运行条件
温度 0°C
最大电流 0.05 mA per IPG strip
样品体积 350 μl (180 mm 长 IPG strip)
电压 时间
30 V 10-12 hours(水化),
200 V 1 hour
500 V 1 hour,
500 -> 8000 V 30 min
8000 V 3 hours (IPG 4 -7); 2 hours (IPG 4-9, 3 -10L, 3-10NL)
低电压时水化， 有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。
7.IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。
8.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 °C 保存几个月。
注意：不推荐每条IPG 胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。
二、不加样品水化
(一) 标准型胶条槽：
1.用适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤3-5，水化过夜。
2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入7.5ml样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入30ml 样品。
3.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表 。
4.进行等电聚焦电泳。
5.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C 保存几个月。
(二)通用型杯上样胶条槽：
1.采用Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行IPG 胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法同步骤3-4，水化过夜。
2.将通用型杯上样胶条槽的尖端与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与IPGphor 仪器的阴极平台接触。
3.将已水化的IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与IPGphor 仪器的两个电极板接触的区域。对于7cm 和11cmIPG胶条，需将IPG 胶条的平端距离胶条槽平端大约1.5cm 处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。
4.在IPG 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽 。
5.取两个IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。
6.分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。
7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。
8.在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。
9.上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样100μl。
10.盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor 仪器的盖子。
11.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。
