在 CELLine CL-1000 培 养 瓶 中 制 备 单 克 隆 抗 体

一、材 料

CELLine CL-1000 生 物 反 应 器 培 养 瓶 ， Inegra Biosciense/ArgosTechnologies 公 司

加 人 2 mmol/L L-谷氨酰胺和 lOOU/m l 链霉素的IM DM 培养基

热灭活的胎牛血清（FBS)

杂交瘤细胞 50X10⁶

无菌尖底离心管（15ml或 50 ml)

血清学移液管（25 ml)

无菌废液缸（如 1.5L 的玻璃烧杯或空培养基瓶）

0.4 % 的台酚蓝染液（ Sigma T 8154)

无 菌 D-PBS

二、设备

血球计数板

光学相差显微镜

台式离心机

CO2 培养箱

三、时间要求

在生物反应器中接种杂交瘤细胞需要 20 min。每次收集细胞培养室的培养基和传代杂交瘤细胞以及更换营养供应室培养基需要30 min。如果操作很小心，杂交瘤细胞系可在独立的生物反应器瓶中生长 1〜3 个 月 ，至少每周更换培养基一次、以起始点的细胞数传代细胞以及收获抗体.

四、细胞接种步骤

1.在抗体制备过程的所有步骤中，营养培养基和细胞室培养基在加入 C ELLine 培养 瓶 前 均 应 37℃ 预热。本 方 案 中 IM DM 是特定的，即杂交瘤细胞必须提前适应在稳定培养环境下生长，如应用于生物反应器中的培养基（如 RPM I、DMEM) 中生长。

2.在超净台中，将 两 室 CELLine 生物反应器从包装中取出。其 为 大 的 T 形 瓶 ，上层的营养培养基室容量为 1L ，可通过瓶颈部一个大的螺旋帽口进人。一个半透性醋酸纤维素膜使该营养培养基室与下层的细胞室分隔开。此膜允许两个腔室之间小分子的自由交 换 ，但阻止大分子扩散到细胞室外，确保将杂交瘤细胞分泌的抗体保留在细胞室。细胞室底部有一层硅胶膜，允 许 供 给 O₂ 和 替 换 CO₂。细胞腔可通过吸量管从位于培养瓶顶部的开口进入，该开口里面装有密闭用的硅胶，瓶口可用螺旋盖帽盖住。

3.检查细胞腔入口的小螺旋帽是否拧紧。吸取含有 5% F B S 的 IMDM 50m l 加入营养培养基室中以平衡半透膜，至少静置 5 min。

4.杂交瘤细胞应在接种到瓶中前1〜2d 用新鲜培养基进行传代以确保细胞处于对 数 生 长 期 。接 种 当 天 用 台 酚 蓝 染 色 法 进 行 细 胞 计 数 ，并 保 证 活 细 胞 比 例 达 到90% 〜 100% 。

5.将 含 有 5 0 X 10⁶ 个杂交瘤细胞的一定体积的培养细胞悬液转移到一个 50ml尖底离心管中,在 200 g 离心力下，室 温 离 心 5min 后获得细胞沉淀。弃 上 清 后 用含 1 5 % FBS 的 IM DM 培养基轻柔地重悬细胞。

6.拧松营养培养基室人口大螺旋帽以避免（当加液体到细胞培养室时）空气闭塞而导致加人细胞腔中的液体回流。每次拧开小螺旋帽打开细胞培养室前都要进行此步操作。

7.用 25ml 吸量管吸取细胞悬液，取下细胞室开口的螺帽，移液管尖端伸进黑色细胞腔端口，将细胞轻轻接种于腔室中。然后将移液管尖端与端口处（硅胶层）压紧以保持密闭，立即将细胞悬液从腔室中吸回并在吸量管中轻轻提升，并将细胞悬液抽吸升到吸量管顶部，直至去除腔室中尽可能多的气泡。将细胞悬液移回腔室，气泡留在吸量管中，然后紧闭旋帽。

8.用一只手持住生物反应器（培养瓶），一端靠在超净台上，培养瓶呈半垂直 （45度角）位并使颈口对着超净台中心。严格按照无菌操作小心地向营养培养基室倒入 950 ml含 有 5 % FBS 的 IMDM。拧紧瓶口螺旋帽，封闭营养培养基室，将瓶子置于适合杂交瘤细胞系生长的最佳 CO₂ 及温度条件的培养箱中。

五、细胞室收集程序

通常首次收获抗体是在接种后的第 7 天进行，随 后 可 每 隔 5〜7d 收获一次。收获前细胞室中活细胞的数量应该达到 350X 10⁶ 个 。
1.保持细胞室入口盖帽盖紧。取下营养室人口的盖帽，小心地向无菌废液缸中倾倒废弃培养基。倾倒应缓慢以避免液体滴落或飞溅。

2.将瓶子放回超净台，拧松营养室螺旋帽，然 后 取 下 细 胞 室 螺 旋 帽 。用 25m l的吸量管轻轻吸取细胞悬液。慢慢抽吸液体使其进出腔室几次以混勻瓶中的细胞悬液，注意总体积并保留 4m l或 20x10⁶ 〜100x10⁶ 个细胞于细胞腔中。如果出现下列情况留在细胞腔中细胞悬液的体积应进行调整：由于渗透通量的关系，细胞室中的体积与接种当天的体积相比已有增加；或 细 胞 生长不充分；或细胞的增长速度明显高于平均水 平 。

3.将收获的液体加入尖底离心管中，确定细胞的数量和活细胞比例，如果有必要，增加或减少留在细胞室中的细胞悬液量，然后拧紧细胞室开口的盖帽。将最终收获液在250 尽离心力下离心 10min, 使细胞沉淀。收获步骤完成时间越短越好，以保持细胞活性和最大限度地缩短因营养室空置后半透膜干燥的时间。

4.在收获液离心时，小心向营养室中倒人 I L 含 有 1 % 〜2 % FBS(根据第一周细胞生长是否良好，血 清 含 量 可 从 最 初 的 有 所 降 低）的 IMD M 来更换营养室培养基。如同接种步骤一样，松开营养室开口的螺旋帽，在细胞室中加入适当体积的含有 15% FBS的 IM DM 并去除气泡，使细胞室的体积恢复至 15 mU 拧紧细胞室及营养室螺旋帽并将
CL-IOOO 生物反应器培养瓶放回培养箱中。

5.将从细胞室收获的上清转移至 50 ml 离心管中，冷冻保存在-80- -20℃。

6.每 隔 5〜7d 再进行相同的收获操作，收集液可合并一起保存。如果生物反应器
再次接种的细胞数为 20x10⁶〜 100 x 10⁶ 个 ，则通常可在 7d 后进行下一次收获。

六、 结果

CELLine CL-1000 细胞室中的细胞密度可高达10⁹ ，但最好争取保持适当的细胞密度从而使每次收获的活细胞数量大约为 500x10⁶ 个 。经 5〜8 周的培养，从 单 个 的 CL-1000 生物反应器中收集 100ml 培养上清，抗体含量为 0. 5〜 2 mg/m l。 通常培养第一周产生的抗体较之后的几周少，但这取决于细胞密度和各自杂交瘤细胞系抗体的产率。周期性地对每次收获抗体的含量进行测定以评估单克隆抗体产量的增加。细胞密度较高时，活细胞比例经常下降到 5 0 % 〜7 0 % ，但经常可在这种情况下得到最多的抗体。
对生长稳定的杂交瘤进行培养，营养室中的培养基可用无血清 IM D M (或其他培养基) 或用专门为培养杂交瘤设计的无血清培养基 [如 H yQSFM4m Ab-U tility (H ycl 〇 ne 并SH30382)] 与原始培养基（含 有 1 % FB S 或无血清）按 I : 1 的比例混合。如果渗透通量没有将细胞室培养基稀释太多, 并且细胞在高密度增殖时活细胞比例高于 5 0 % 并持续分泌抗体，那么细胞室内血清含量有时可减至 5 % 。如果所感兴趣的杂交瘤细胞系能用杂交瘤细胞专用的无血清培养基稳定培养并分泌抗体，则 在 C E L L in e 生物反应器中制备其单克隆抗体时也可在整个培养过程都使用该无血清培养基。