从植物组织中分离高尔基体

新鲜组织
匀浆介质
研钵和杵 离心机

1. 先用剪刀大致剪切叶片或茎杆，然后在少量的介质中用刀片切成碎片。

2. 对于 1 g 新鲜组织，在 1 ml 介质中用研钵和杵捣碎使组织匀浆化。

匀浆介质：

50 mmol/L FiEPES

10 mmol/L KCI

1 mmol/L EDTA

10 mmol/L 抗坏血酸

0.1% BSA

5 mmol/L DTT，pH 7.5

0.4 蔗糖

3. 用单层的 Miracloth 挤压浓缩的匀浆液以除去没有破碎的细胞、细胞壁和细胞碎片。

4. 将匀浆液转移至 35 ml 或 50 ml 的离心管中。

5. 用吊桶式转头以 1000 g 离心 10 分钟来除去细胞核、淀粉和完整的叶绿体。

6. 将 1000 g (10分钟）的离心上清铺到不连续的蔗糖梯度上，梯度是在 35 ml 的管中用含有 4 ml 的 37% (w/v) 的蔗糖和 8 ml 21.5% 的蔗糖制备的。




7. 以 22000 r/min 离心 30 分钟（65000 g，Spinco SW28 转头）。

8. 将位于匀浆液与 21.5% 蔗糖界面处的膜（为内质网）以及位于 22.5%-37% 蔗糖界面处的膜（为高尔基体）收集于不同的管中，悬于梯度上层的黄色清亮上清中 。

9. 以 20000 r/min ( 50000 g，SW28 转头）离心 20 分钟或以相似的条件（17000 r/min 30分钟，35000 g，SS-34 Sorval 转头）离心使重悬后的物质沉淀出来。

10. 为除去污染的质体和质膜，将沉淀重悬于含有 5 mmol/L 磷酸钾（pH 6.8 ) 的 0.5 ml 的 0.25 mol/L 蔗糖中，然后加到含有 5.9% PEG 4000 和 5.9% (w/w) 葡聚糖 T-500 ( Phamiada) 的 4-g 两相系统中。

11. 在冰浴达到平衡之后，每一只两相管用石蜡封口膜盖住并用拇指按下；将管子在低温下作 40 次剧烈翻转之后重新在冰浴中平衡。

12. 用低速离心（750 r/min，100~200 g，10分钟）分相。

13. 分别收集上相（含界面）和下相，用不含蔗糖和膜的匀浆介质稀释。

14. 以 20000 r/min ( 50000 g）离心 20 分钟收集。