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从培养的哺乳动物细胞中分离高尔基体

相关实验:高尔基体的分离实验

最新修订时间:

材料与仪器

细胞
粗匀浆液
塑料离心管

步骤

1. 向 6 ml 的粗匀浆液中(细胞收获后以大约 5X105 /ml 悬于 0.25 mol/L 蔗糖,10 mmol/L pH 7.4 的 Tris-HCl 中),加入 6 ml 含有 10  mmol/L pH 7.4 Tris-HCl 的冰浴的 2.3 mol/L 蔗糖,将蔗糖浓度调整到 1.4 mol/L。

2. 加入 100 mmol/L 的 Na2EDTA 母液并混合使终浓度为 1 mmol/L。

3. 将混合物加入到一只干净的 SW27 塑料离心管中(例如 polyallomer),然后用 14 ml 的 1.2 mol/L 蔗糖,10 mmol/L pH 7.4 的 Tris-HCl 覆盖,再加入 9 ml 的 0.8 mol/L 蔗糖-10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)。

4. 将梯度溶液在 SW27 转头中以 25000 r/min ( 90000 g) 离心 2.5 小时。

5. 用巴斯德吸管或用注射针头以最小的体积回收位于 0.8 mol/L/1.2 mol/L 蔗糖界面处的混浊带,然后可以将膜成分离心沉淀出来。

来源:丁香实验

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