植物组织中氨基转移反应及氨基酸的层析分离

相关专题

 

一、目的
转氨基作用是植物 界普遍存在的一种生化反应，它使蛋白质、氨基酸代谢
与碳水化合物、脂肪等代谢沟通起来，在一定程度上起平衡蛋白质、脂肪等代
谢的作用。研究植物体转氨基作用，可以使我们了解植物体不同发育阶段代谢
动态的一个侧面，从而探索控制其代谢的途径。
二、原理
通过转氨基作用，α—氨基酸上的氨基可能转移到α—酮基的位置上，结
果形成一种新的α—酮酸和一种新的α—氨基酸。所生成的氨基酸可用纸上层
析法检出。
三、仪器和试剂
1．仪器：
研 钵 恒温箱 量筒（10毫升）
离心机 试管3支 层析缸
滤 纸 吹风机 移液管（0.5ml×3；2ml×1）
毛细管 漏 斗 离心管
2．试剂：
（1）0.1M丙氨酸
（2）0.1Mα—酮戊二酸（NaOH中和至pH7）
（3）含有0.4M蔗糖的0.1M pH8.0磷酸缓冲液
（4）0.1M谷氨酸、0.1—0.25%茚三酮丙酮溶液
（5）推动剂（酚：水＝3：1或4：1）
四、操作
1.酶液的制备：取发芽2-3 日的绿豆芽3 克（去皮），放入研钵中，加2
毫升pH8.0磷酸缓冲液研成匀浆，转入离心管。研钵再用2毫升缓冲液冲洗，
并入离心管，于8000转/分离心10分钟，取上清液备用。
2．酶促反应：取三支试管，按下表分别加入试剂和酶液：

摇匀后置试管于37℃恒温中保温30分钟。取出后各加3滴30%乙酸终止酶活动，于沸水浴上加热10分钟，使蛋白质完全沉淀，冷却后离心或过滤、取上清液或滤液备用。
3．层析：取层析滤纸一张，在距底边2厘米处用铅笔划一水平线，在线上等距确定5个点，作点样位置。相邻各点相距2.5厘米。取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液用五支毛细玻管分别点样。反应液点5-6滴，标准液点2滴。每点一次用吹风机吹干后再点下一次。不要点得太多，斑点直径不超过3 ㎜为宜（5 支毛细管勿混淆）。
在层析缸中放入酚水推动剂(3：1或4：1)，待缸内蒸气饱和后，将滤纸垂直放入，展层，层析纸纸边不能迭在一起或与缸壁接触。盖好缸盖，待溶剂上升至10-15 ㎝时，小心取出滤纸用铅笔划出溶剂前沿线，用电吹风烘干。
4．显色：用喷雾器喷上0.1%茚三酮丙酮溶液，置烘箱(80℃)或用热吹风机加热显色，此时可见紫色斑点。
五、结果分析
样品层析后，常用相对移动速率Rf 来表示各组分在层析谱上的位置：

Rf 值与欲分离物质的性质存在一定的关系，在一定条件下是常数。从层析图谱上鉴定α-酮戊二酸和丙氨酸是否发生了转氨基反应并写出反应式。
六、注意事项
1.品不要点得太多，斑点直径不超过3 ㎜为宜。
2. 层析纸质量要好一点，否则容易弯曲，层析效果不好。层析时，且纸边不能迭在一起或与缸壁接触。