70S核糖体的纯化

核糖体
致密偶联缓冲液
Beckman Vti50 转头

1. 采用 Beckman Vti50 转头和 7% 至 30% (w/v) 的线性蔗糖梯度沉降来纯化 70S 真细菌的核糖体。这一步可以确保大的蛋白质聚集物不会与 70S 核糖体一起沉淀下来。并可以产生致密偶联的 70S 核糖体。

2. 将沉淀重悬在一个小体积的致密偶联的缓冲液，测量样品在 OD₂₆₀ 的吸收并将样品稀释至 100~150 OD₂₆₀ 单位/ml。

致密偶联缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

6 mmol/L MgOAc

50 mmol/L NH₄Cl

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

3. 用致密偶联缓冲液制备 7% 和 30% (W/W) 的蔗糖缓冲液，将蔗糖溶液用 Millpore 滤膜过滤（HA 0.45 μm，Milbpore Filter)。

4. 线性蔗糖梯度是在为 Beckman 超速离心机的 Vti50 转头准备的 39 ml 管中制备的。首先自下而上地向管底倒入 18.5 ml 7% 的蔗糖溶液。然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，这样使高密度的蔗糖将低密度的蔗糖“托起“。在 4℃ 放罝 2~16 小时使密度梯度形成。

5. 将样品于 42℃ 保温 5 分钟使之热激活，向每一密度梯度（假设为 39 ml 的梯度）上加载 200 OD₂₆₀ 单位的粗制裂解物。

6. 用 Beckman Vti 50 转头以 85000 g 离心 100 分钟。

7. 于冷室中将梯度进行分部收集。每一分部用 ISCO 密度梯度分部收集器收集 15~30 滴。直接于 300 nm 测定各分部的 UV 吸收，或作 100 倍稀释后测定 260 nm 处的 UV 吸收。确定梯度的 A₂₆₀ 曲线并定位 70S 核糖体峰及每个已解离亚基的峰。

8. 用 Beckman 50.2 Ti 转头于 4℃ 以 100000 g 离心 16 小时，分別将含有 70S 核糖体的吸收峰分部及已解离的 30S 和 50S 亚基沉降开来。

9. 沉淀可以保存在 -80℃。