核糖体及多核糖体的分离

细胞
蔗糖溶液 高盐蔗糖铺垫液 蔗糖铺垫缓冲液 重悬缓冲液

1. 为从剩余的细胞组分中分离核糖体，将不含细胞碎片的粗制裂解液以 1：1 的比例铺到 1.1 mol/L 的蔗糖溶液之上。于 4℃ 在Beckinan 50.2 Ti 恒定角度转头中离心，这一过程包括长时间的离心以使 70S 核糖体沉降，同时分离 30S 和 50S 核糖体亚基；较低的离心速度用于初步将 70S 核糖体沉淀出来，而 50S 或 30S 亚基则不沉淀。

(1) 真细菌核糖体

高盐蔗糖铺垫液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

50 mmol/L MgOAc

100 mmol/L NH4Cl

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

1.1 mmol/L 蔗糖

以 100000 g 离心 16 小时来沉降 70S 核糖体，可以更换蔗糖铺垫液 2 至 3 次直到获得干净的沉淀物。对于产甲烷菌（mefftancgem)，盐杆菌及硫代谢嗜热菌（eocytes， sulfur-metabolizing )，至少应用高盐溶液洗两次以确保将非核糖体沉淀去除掉。

(2) 哺乳动物核糖体

蔗糖铺垫缓冲液：

50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

5 mmol/L MgCl2

25 mmol/L KCl

2 mmol/L 蔗糖

以 100000 g 离心 24 小时，沉淀中含有多核糖体，可贮存于 -80℃ 中。

(3) 植物核糖体和多核糖体

蔗糖铺垫缓冲液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6

5 mmol/L MgCl₂

50 mmol/L ~ 200 mmol/L NH₄CI

60% 蔗糖

以 150000 g 离心 3 小时。用重悬缓冲液洗沉淀物，然后悬于 200 μl 重悬缓冲液中。

重悬缓冲液：

50 mmol/L KCl

20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6

5 mmol/L MgCl₂

对多核糖体的进一步纯化可转至多核糖体的纯化步骤。

(4) 叶绿体核糖体

高盐蔗糖铺垫缓冲液

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

10 mmol/L MgOAc

150 mmol/L KCl

6 mmol/L β-巯基乙醇

1 mol/L 蔗糖

以 55000 g 离心 12 小时。为除去蔗糖，用不含蔗糖的上述缓冲液漂洗并将沉淀重悬，然后于 4℃ 以 10000 g 离心 10 分钟使悬液澄清。将含有核糖体的沉淀贮存于 -80℃ 或继续进行下面的分离步骤。

2. 到这一阶段，含有核糖体的沉淀已经可以直接使用贮存于 -80℃ 或进一步纯化。