细菌细胞的制备实验实验
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简介
来源：丁香实验
操作方法
1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。 2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分钟。 3. 细胞破碎： (1) 真细菌的 70S 核糖体 弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
核糖体及多核糖体的分离1. 为从剩余的细胞组分中分离核糖体，将不含细胞碎片的粗制裂解液以 1：1 的比例铺到 1.1 mol/L 的蔗糖溶液之上。于 4℃ 在Beckinan 50.2 Ti 恒定角度转头中离心，这一过程包括长时间的离心以使 70S 核糖体沉降，同时分离 30S 和 50S 核糖体亚基；较低的离心速度用于初步将 70S 核糖体沉淀出来，而 50S 或 30S 亚基则不沉淀。 (1) 真细菌核糖体 高
70S核糖体的纯化1. 采用 Beckman Vti50 转头和 7% 至 30% (w/v) 的线性蔗糖梯度沉降来纯化 70S 真细菌的核糖体。这一步可以确保大的蛋白质聚集物不会与 70S 核糖体一起沉淀下来。并可以产生致密偶联的 70S 核糖体。 2. 将沉淀重悬在一个小体积的致密偶联的缓冲液，测量样品在 OD260 的吸收并将样品稀释至 100~150 OD260 单位/ml。 致密偶联缓冲液： 10
多核糖体的纯化一、真细菌多核糖体 1. 含有多核糖体（每管 0.6 ml ) 的上清铺到 15%~30% 蔗糖梯度的上面，在该蔗糖梯度的下面为 0.5 ml 的 60% 蔗糖铺垫液，内含如下缓冲液： 多核糖体蔗糖梯度缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl2 150 mmol/L NH4CI 2. 用 Berkman SW 50.1 转头，以 2450
将核糖体解离为大亚基和小亚基1. 通过将核糖体样品对解离缓冲液透析并用 7%~30% 的线性蔗糖梯度离心来将真细菌 70S 核糖体分离为 30S 和 50S 亚基。 解离缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH4Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 2. 测量样品在 A260 下的光吸收，将样品用解离缓冲液稀
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