从生长于微载体上的细胞中分离细胞膜

细胞
CB
微型离心机 临床台式离心机 超离心机 吊桶式转头 离心管 振荡器 尼龙单丝网 探头超声仪

1. 准备下列仪器：

微型离心机

临床台式离心机

超离心机

吊桶式转头和合适的离心管

振荡器

尼龙单丝网，孔径约 50 μm

探头超声仪

2. 将微载体培养物转移到 50 ml 的锥形离心管中。

3. 用无血清培养基或含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 溶液洗涤微载体上的细胞两次。

4. 用冰冷 CB 洗涤细胞一次。

5. 微载体在 1 g 重力下下沉的过程中，锥形离心管要埋在冰里。

6. 倒掉 CB 溶液，加 5 ml 有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。让珠于下沉，吸掉裂解缓冲液上清，加 5 ml 新的有蛋酶抑制剂的裂解缓冲液。

7. 让珠子下沉，置冰上 30 分钟。

8. 振荡珠子以裂解细胞，不时用相差显微镜监控样品的裂解程度。

9. 细胞完全裂解以后，用 50 μm 尼龙单丝网过滤珠子混合物以滤出微载体珠子：将尼龙单丝网覆盖在 50 ml 锥形离心管上，将珠子混合物通过尼龙网倒入离心管中。

10. 用裂解缓冲液洗涤微载体珠子一次，并将洗下来的液体与原来的顶层膜混合。照第 13 步的方法将硅胶包被的顶层膜与中间膜和细胞核分离开。

11. 将留有微载体的尼龙网上下翻过来覆盖于一个干净的 50 ml 锥形离心管上，用新鲜裂解缓冲液将微载体从尼龙网上洗到离心管中，让微载体珠沉下来。去掉裂解缓冲液上清，用小体积的含 2% SDS 的裂解缓冲液将基底膜从微载体珠上溶解下来，收集基底膜。

12. 将混合物经过微型离心管中的尼龙网以去除微载体珠，弃去微载体，煮沸 SDS 溶解的基底膜部分。煮沸后通过沉淀去除任何残留的二氧化硅，将含有溶解的基底膜的 SDS 溶液保存于 -20℃ 或 -80℃ 待用。

13. 用一步或两步法将硅胶包被的顶层膜同中间膜分离。